Imágenes de catodoluminiscencia de estructuras celulares marcadas con complejos luminiscentes de iridio o renio a temperaturas criogénicas

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13432 (2022) Citar este artículo

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Reportamos por primera vez el uso de dos agentes de imágenes de células vivas del grupo de complejos de metales de transición luminiscentes (IRAZOLVE-MITO y REZOLVE-ER) como sondas catodoluminiscentes. Esta primera demostración experimental muestra la aplicación de ambas sondas para la identificación de estructuras celulares a nanoescala y cerca del estado nativo directamente en el microscopio electrónico de barrido criogénico. Este enfoque puede aplicarse potencialmente a enfoques correlativos y multimodales y usarse para apuntar a regiones específicas dentro de muestras vitrificadas a bajas energías de haz de electrones.

La microscopía electrónica revela estructuras celulares con un detalle increíble; sin embargo, la localización específica de estructuras a nanoescala en su entorno criofijado nativo aún está en pañales. Los enfoques actuales para localizar las estructuras a temperatura ambiente incluyen el marcaje con oro inmunológico y de afinidad y, con menos frecuencia, el marcaje químico1. Otra posibilidad es la incorporación de etiquetas bioortogonales, etiquetas expresadas genéticamente o sondas fluorescentes, cuyas detecciones se correlacionan con la ultraestructura en la misma célula (microscopía óptica y electrónica correlativa) con microscopía de superresolución y microscopía de criofluorescencia2,3,4,5. Estas tecnologías de imagen, que han avanzado rápidamente en los últimos años, proporcionan un progreso significativo en la comprensión de cómo funcionan las moléculas en el contexto estructural.

Aquí exploramos el uso de las sondas IRAZOLVE-MITO y REZOLVE-ER para obtener imágenes de catodoluminiscencia (CL). CL es la emisión de fotones de un material en respuesta a la excitación de electrones acelerados. La detección de la emisión de CL de muestras biológicas6,7, fluoróforos orgánicos8,9,10, proteínas y puntos cuánticos de semiconductores11 es extremadamente desafiante debido a las señales ópticas de baja intensidad que se blanquean aún más rápidamente bajo el haz de electrones acelerados debido al daño estructural de la biología. material. Por el contrario, los nanocristales inorgánicos luminiscentes (p. ej., nanodiamantes o nanocristales dopados con elementos de tierras raras) han adquirido una importancia cada vez mayor como sondas CL brillantes y estables con espectros de emisión estrechos12,13,14,15,16,17,18. Los nanocristales dopados con elementos de tierras raras pueden ser potencialmente útiles para la microscopía electrónica CL correlativa (multicolor). Específicamente, los nanocristales de YVO4:Bi3+, Eu3+ y Y2O3:Tb3 se detectaron simultáneamente con CL y BSE a voltajes de aceleración de electrones bajos (≤ 2 kV) dentro de células endoteliales vasculares humanas en bloques de resina epoxi utilizando Microscopía Electrónica de Barrido con Haz de Iones Focalizados (FIB-SEM )19. FIB-SEM se utilizó para detectar partículas LaF3:Tb3+ dentro de compartimentos endocíticos de células humanas incrustadas en resina epoxi12. Los nanocristales (por ejemplo, Y2O3∶Tb3+, Y2O3∶Eu3+, LaF3:Tb3+), que tienen alrededor de 10 nm de diámetro, mostraron una notable resistencia de la señal CL frente a la exposición del haz de electrones incluso a un alto voltaje de aceleración (80 keV, 2 nA , 100 ms/píxel). Retuvieron la intensidad de CL en más del 97 % en comparación con la intensidad inicial durante 1 min20.

Las sondas IRAZOLVE-MITO y REZOLVE-ER se diseñaron para imágenes de lapso de tiempo21,22. REZOLVE-ER, químicamente fac-[Re(CO)3(1,10-fenantrolina)(4-piridiltetrazolato)], se localiza específicamente en la membrana nuclear y el retículo endoplásmico y también permite la detección de eventos exocitósicos en la membrana plasmática21. IRAZOLVE-MITO (iridio complejado con 2-fenilpiridina ciclometalada y el ligando 5-(5-(4-cianofen-1-il)pirid-2-il)tetrazolato) tiene una alta especificidad por las mitocondrias en células vivas, y su espectro de emisión está en el rango de 505–625 nm22. Ambas sondas penetran rápidamente en la membrana celular, tienen baja citotoxicidad, son resistentes al fotoblanqueo y, a diferencia de los fluoróforos orgánicos, tienen una vida útil prolongada en estado excitado que oscila entre cientos de nanosegundos y milisegundos23. La duración prolongada del estado excitado proviene de la disposición estructural de las sondas y la naturaleza de la multiplicidad de tripletes excitados de Ir y Re21,22. Los complejos de metales de transición permiten el acceso a nuevos estados de electrones debido a la presencia de centros metálicos de bloque d. Esto da lugar a sus propiedades fotofísicas y fotoquímicas únicas (alta resistencia al fotoblanqueo, vida útil prolongada del estado excitado y baja citotoxicidad durante un tiempo de exposición prolongado), lo que hace que estas sondas sean valiosas para la obtención de imágenes de células vivas a largo plazo23,24,25.

Primero empleamos microscopía holográfica en combinación con fluorescencia para visualizar patrones de tinción in vivo de REZOLVE-ER e IRAZOLVE-MITO en células Vero. Los tintes se usaron en concentraciones de 50 µM y 20 µM, respectivamente, y se incubaron durante 30 min o durante la noche (consulte la Información de apoyo). Se observó tinción con REZOLVE-ER en la red reticular alrededor del núcleo, mientras que IRAZOLVE-MITO se acumuló dentro de estructuras similares a vesículas, probablemente lisosomas. Sin embargo, en las células que se prefijaron antes de la aplicación de IRAZOLVE-MITO, el patrón de tinción cambió y se marcaron las estructuras granulares y filamentosas que se extendían por todas las células (Fig. 1). Se observó una observación similar en células Vero teñidas con una tinción mitocondrial MITOBLUE (derivado de bisbenzamidina fluorescente)26.

Las sondas REZOLVE-ER e IRAZOLVE-MITO se utilizaron para obtener imágenes del retículo endoplásmico y las mitocondrias de las células Vero, respectivamente. Microscopio holográfico 3D Cell Explorer (Nanolive). Barra 20 µm. RI (el índice de refracción).

Las imágenes CL se realizaron en células congeladas a alta presión teñidas que se fracturaron por congelación antes de la observación con microscopía electrónica de barrido criogénico (crio-SEM). Descubrimos que REZOLVE-ER (Fig. 2, panel izquierdo) e IRAZOLVE-MITO (Fig. 3) exhiben una fuerte señal de CL que coincidía estrechamente con la fluorescencia (Fig. 1).

SEM de células Vero fracturadas por congelación teñidas in vivo con REZOLVE-ER. Las imágenes correspondientes se tomaron utilizando el detector de catodoluminiscencia (CL) Crytur y el detector Everhart-Thornley (SE) a -140 °C y 5 keV. La imagen CL se coloreó y se fusionó con la imagen SE para ilustrar la superposición estructural exacta. La señal CL ayudó a encontrar posiciones de células teñidas en el área fracturada e identificar compartimentos celulares etiquetados. La flecha marca la celda intacta. SEM JEOL 7401F. Barras: 10 µm.

Microscopía electrónica de barrido crio-catodoluminiscente (CL) correlativa de células Vero teñidas con IRAZOLVE-MITO. (A-E) Las células teñidas in vivo se congelaron, fracturaron y tomaron imágenes a -135 °C utilizando el detector Crytur CL (4 keV) y el detector Everhart-Thornley (ETD, 1 keV). (F-H) Las células prefijadas químicamente se tiñeron, se congelaron a alta presión y se tomaron las imágenes correspondientes a 4 keV usando CL (F) y ETD (G). Barras: 1 µm (A–E), 10 µm (F–H). SEM JEOL 7401F. CL y las imágenes topográficas se fusionaron manualmente (A, H).

En el cryo-SEM, CL permitió un mapeo rápido de orgánulos teñidos en grandes áreas y permitió distinguir las células intactas incrustadas dentro del medio vitrificado, lo que facilitó la navegación a las regiones de interés. A bajo aumento, CL reveló claramente la forma de las células y la posición de los núcleos. Las imágenes consecutivas de electrones secundarios proporcionaron datos topográficos de la muestra, lo que permitió la identificación de orgánulos adicionales (Fig. 2, panel izquierdo; Fig. 3D, E). Dado que los parámetros de adquisición no coincidían con las mediciones topográficas (1 kV) y CL (4 kV), el registro se realizó manualmente utilizando puntos de referencia definidos. Se usaron células sin teñir como controles negativos para confirmar que las configuraciones usadas para la visualización de IRAZOLVE-MITO y REZOLVE-ER no detectaron CL endógeno (datos no mostrados).

También apuntamos a encontrar cómo los pasos individuales del protocolo de preparación SEM convencional a temperatura ambiente afectan la señal CL. En contraste con las células hidratadas congeladas (Fig. S1A), las células fijadas con aldehído deshidratadas con solventes orgánicos (etanol, acetona) a temperatura ambiente no mostraron señal CL. La señal CL se conservó parcialmente después del secado al aire (o secado con bomba rotatoria); sin embargo, se blanqueó casi inmediatamente bajo la excitación del haz de electrones (Fig. S1B, C).

El CL se tomó de forma independiente utilizando dos detectores CL distintos: el detector Crytur CL (Figs. 2, 3, Figs. S1, S3, S5) o el detector MonoCL4 + CL de Gatan (solo Fig. S2) montado en el SEM Magellan 400L , donde también medimos los espectros de emisión de CL a 5 kV, 0,1 nA y -140 °C. El espectro CL de la tinción de REZOLVE-ER mostró una banda de emisión inicial dominante centrada alrededor de 550 nm (Fig. 4A), que se correspondía con un perfil de emisión para REZOLVE-ER entre 500 y 650 nm27. La banda de emisión CL dominante de IRAZOLVE-MITO estaba en la región de 520 nm (Fig. 4B). Sin embargo, la dosis de electrones absorbidos, que aumentó linealmente durante la adquisición espectral de CL en serie, podría blanquear los complejos de iridio y, por lo tanto, afectar el registro de espectros en longitudes de onda más largas. El IRAZOLVE-MITO excitado a 403 nm tuvo un intervalo de emisión de 505 a 625 nm24. Ambos máximos de emisión de CL se obtuvieron a -140 °C y presumiblemente están desplazados hacia el azul en comparación con los máximos de emisión de luminiscencia obtenidos a temperatura ambiente. El desplazamiento hacia el azul de los máximos de emisión de luminiscencia de los complejos organometálicos obtenidos a -196 °C frente a la temperatura ambiente se observó anteriormente y se explicó con el efecto rigidocrómico27.

Los espectros de emisión CL de las sondas REZOLVE-ER (A) e IRAZOLVE-MITO (B) se muestran en turquesa. (A) A modo de comparación, el espectro de absorbancia/emisión de REZOLVE-ER es de 350–405 nm/500–650 nm (verde) según la hoja de datos. La banda ancha de emisión de IRAZOLVE-MITO en CH2Cl2 está centrada en ~605 nm24. Los espectros de emisión de CL se midieron con el detector MonoCL4 a -135 °C. Los dominantes fueron bandas en aprox. 550 nm para REZOLVE-ER (A) y 525 nm para colorante IRAZOLVE-MITO (B).

El voltaje de aceleración más bajo que generó la emisión CL de ambas sondas fue de 2 kV; sin embargo, la relación señal-ruido óptima se obtuvo a 4–5 kV (Fig. S3A) y corrientes de sonda de 30–300 pA (Fig. S3B,C).

Con estos parámetros, estimamos la resolución espacial y lateral de la señal CL en función de la simulación Monte Carlo de dispersión de electrones. Las simulaciones permiten estimar cuantitativamente la generación de CL en una muestra a granel (aquí hielo amorfo como parte predominante de una muestra biológica) dentro del volumen de interacción de electrones (Fig. S4A). La intensidad CL más alta alrededor de la posición real del haz disminuye significativamente con el aumento del radio, pero aún interfiere en cientos de nm con un fondo significativo (Fig. S4B). En el eje z, estimamos que la mayor parte de la señal CL se genera a profundidades de alrededor de 250 nm bajo la superficie. Está dado por un volumen irradiado significativamente más alto incluso si menos del 20% de la intensidad del haz inicial alcanza esta profundidad. En el plano xy, la mayor parte de la señal (más del 60 %) se genera a partir de un radio < 8 nm (el diámetro del haz simulado es de 4 nm). Estos valores teóricos se ven muy afectados por la falta de homogeneidad de la muestra, la distribución de partículas/compuestos emisores de CL o la refracción/absorción de la luz en muestras reales. La resolución se puede mejorar solo con la disminución de la energía del haz primario o utilizando una muestra transparente a los electrones donde la característica forma de pera de la interacción de los electrones no se está desarrollando por completo. Los siguientes factores limitantes son la sensibilidad del detector CL, la distancia de trabajo y la estabilidad de las muestras bajo el haz de electrones.

Bajo parámetros seleccionados (4 kV, 15 µs, 300 pA, − 140 °C), comparamos el decaimiento de la señal CL de los perfiles de intensidad medidos en las estructuras teñidas con IRAZOLVE-MITO sin y con recubrimiento de oro (~ 2 nm) ( figura 5). A partir de las mediciones de las intensidades de CL en 25 áreas de CL sin recubrimiento de la primera y las siguientes tres imágenes SEM, calculamos la intensidad media de píxeles para cada imagen (se excluyó el área 6, consulte la Fig. 5A; la Fig. S5).

Decaimiento de las intensidades de catodoluminiscencia del colorante IRAZOLVE-MITO (sin y con nanocapa de oro pulverizada) medido en cuatro imágenes consecutivas tomadas con los mismos parámetros del detector CL y el SEM (4 keV, 15 µs, 300 pA, 10,367 px/nm). (A) El gráfico muestra los cambios en las intensidades de CL medidos en los primeros tres escaneos consecutivos. (B) Las intensidades de CL se midieron sobre el área sin recubrimiento representativa (se muestra el área 25 de la Fig. S5 A) desde la primera hasta la cuarta imagen (de izquierda a derecha). El plano azul representa el nivel del valor medio de fondo.

Encontramos que la señal CL disminuyó entre la adquisición de la primera y la segunda imagen SEM en muestras sin recubrimiento en ~ 7,4%, luego ~ 3,4% y ~ 5,5% hasta el valor de ~ 83,8% (la cuarta imagen SEM) (Fig. 5A, izquierda). En las muestras recubiertas, CL disminuyó ~ 5,4 %, luego ~ 3,2 % y ~ 4,8 % hasta el valor de ~ 86,7 % (Fig. 5B, derecha). Las intensidades en escala de grises de un área seleccionada se muestran en la Fig. 5B. En comparación, los fluoróforos orgánicos se blanquearon bajo el haz de electrones (2 kV, 0,8 nA, equivalente a una dosis de 0,04 nC/μm2) casi inmediatamente19. Los puntos cuánticos (CdSe/CdS) mostraron una emisión de CL muy reducida (en un 30 %) en los primeros 10 s (equivalente a una dosis de 0,08 nC/μm2), mientras que la caída en la intensidad de emisión de los nanocristales dopados con elementos de tierras raras fue de 10 –20% en los primeros 10 s (equivalente a una dosis de 0,04 nC/μm2)19.

Aquí, demostramos que los tintes IRAZOLVE-MITO y REZOLVE-ER21,22 producen una señal CL, que puede usarse para estudios correlativos que combinan imágenes en vivo y CL-SEM a temperaturas criogénicas. La ventaja de este enfoque es que se pueden realizar estudios de localización e imágenes estructurales a temperaturas criogénicas simplemente en un instrumento SEM sin múltiples transferencias de muestras típicas de los flujos de trabajo SEM de criofluorescencia no integrados4,5. El enfoque de imágenes Cryo CL-SEM puede liberar el potencial del CL para localizar moléculas en el volumen celular utilizando las técnicas de imágenes cryo-FIB-SEM, cryo-block-face, y puede ser una alternativa a la microscopía electrónica de fluorescencia crio-correlativa integrada flujo de trabajo (p. ej., "iCorr" o microscopio electrónico de iones de fotones)28,29.

A diferencia de los nanocristales y nanodiamantes dopados con elementos de tierras raras que se utilizan principalmente para marcar específicamente componentes en la vía endocítica, IRAZOLVE-MITO y REZOLVE-ER se han diseñado para la obtención de imágenes biológicas como colorantes alternativos específicos de orgánulos. La aplicación generalizada de CL en bioimagen actualmente está limitada por la disponibilidad de sondas CL de alta intensidad dirigidas a estructuras de interés, su estabilidad insuficiente bajo el haz de electrones y la falta de sondas con espectros de emisión distintos que permitirían CL-SEM multicolor. Las propiedades de CL también deben probarse para las etiquetas IRAZOLVE-ALKYNE y REZOLVE-ALKYNE, así como para otros complejos de iridio o renio fotoluminiscentes novedosos, ahora sondas bien establecidas que se utilizan en la investigación en ciencias de la vida23,30,31,32. Por ejemplo, complejos de tricarbonilo de renio(i) que incorporan 1,10-fenantrolina o 3-clorometilpiridil bipiridina que se acumulan en las mitocondrias33,34, un complejo de renio unido a 4-cianofeniltetrazolato (disponible comercialmente como REZOLVE-L1), que tiene afinidad por lípidos polares (específicamente a fosfatidiletanolamina, esfingomielina, esfingosina), y finalmente un complejo de renio 3-piridiltetrazolato, que se localiza dentro de los lisosomas34. Se diseñó otra nueva sonda, un complejo de iridio ciclometalado, para visualizar microtúbulos mediante microscopía óptica y electrónica35. Los complejos de iridio organometálicos fosforescentes también se han utilizado recientemente para detectar la viabilidad de las diatomeas36. Otras sondas luminiscentes incluyen complejos de polipiridina de iridio (III)37, que presentan actividad fotocitotóxica tras la irradiación prolongada con láser38.

En conclusión, este estudio muestra que las sondas de luminiscencia del grupo de complejos de iridio y renio, IRAZOLVE-MITO y REZOLVE-ER, generan señales CL detectables en muestras vitrificadas a bajas energías de haz de electrones. Realizamos imágenes de CL y topografía en células fracturadas por congelación y descubrimos que la intensidad de CL del colorante IRAZOLVE-MITO se redujo en un 16 % en muestras sin recubrimiento y en un 13 % en muestras recubiertas entre la primera y la cuarta adquisición de imágenes de CL de la misma región tomada en − 140 °C, 4 kV, 300 pA y 15 µs. Dado que las imágenes CL se pueden integrar fácilmente en imágenes multimodales simultáneas que ofrece el SEM moderno, creemos en el gran potencial del uso de sondas específicas de orgánulos como IRAZOLVE-MITO y REZOLVE-ER en imágenes biológicas de alta resolución. Los tintes se pueden usar para seleccionar regiones objetivo antes de la molienda crio-FIB o realizar CL-SEM correlativo como se demuestra en este estudio.

Se cultivaron células epiteliales de las vías respiratorias humanas A549 en medio DMEM bajo en glucosa con suero fetal bovino al 10 %, ATB al 1 % (penicilina, estreptomicina) y glutamina al 1 % estable a 37 °C y CO2 al 5 %. Los cultivos celulares de Vero E6 se cultivaron en medio alto en glucosa FLUOROBRITE DMEM con ATB a 37 °C y 5 % de CO2. Las células se sembraron en matraces de cultivo de tejidos de 25 cm2 o en una cámara de imágenes de 35 mm de placa µ con fondo de vidrio (Ibidi) para lograr una confluencia del 80-100 %. REZOLVE-ER e IRAZOLVE-MITO (ambos ReZolve Scientific, consulte los agradecimientos para obtener más detalles) se disolvieron en DMSO a 10 mM (soluciones madre). Las células se tiñeron en presencia de medios de cultivo añadiendo la solución madre de REZOLVE-ER (a concentraciones finales de 33 o 50 µM) o IRAZOLVE-MITO (20 µM, 40 µM). Se tomaron imágenes de las células in vivo mediante un microscopio holográfico 3D Cell Explorer (Nanolive) después de 30 min o de incubación durante la noche. En el caso de la tinción con IRAZOLVE-MITO, las células se tiñeron y se tomaron imágenes después de la fijación en formaldehído al 4 % en HEPES 0,1 M durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de un paso de lavado de 30 min.

Las células sedimentadas se congelaron a alta presión (EM ICE, Leica Microsystems) en presencia de albúmina sérica bovina al 20 % y se transfirieron al microscopio electrónico de barrido (SEM) JEOL 7401F (JEOL Ltd.) equipado con un accesorio criogénico CryoALTO 2500 (Gatan, Inc.) preenfriado a -140 °C. Las células se fracturaron por congelación, opcionalmente se grabaron por congelación a temperaturas entre -98 °C y -95 °C durante 10 s, y se recubrieron con oro durante 10 s con oro (~ 2 nm). Las imágenes se tomaron utilizando el detector de electrones secundarios Everhart-Thornley y el detector CL diseñado por Crytur comp. El detector CL detecta señales CL pancromáticas con una alta relación señal-ruido en el rango espectral de 330 a 600 nm. Este detector CL retráctil de tipo espejo parabólico consta de una guía de luz de cuarzo y el fotomultiplicador. Los ajustes de contraste y brillo del detector de CL durante las mediciones de intensidad de CL fueron constantes.

La observación independiente se realizó utilizando el SEM Magellan 400L (ThermoFisher Scient.) equipado con detector MonoCL4 + CL (Gatan, Inc.) en un rango de temperaturas de -125 °C a -150 °C. La fracturación por congelación y el recubrimiento de Au/Pt (aprox. ~ 2,7 nm) se realizaron utilizando el recubridor por pulverización Leica ACE 600 (Leica Microsystems). Las imágenes CL y los espectros se tomaron con una energía de haz de 7 keV y una corriente de sonda de 0,1 nA.

Las células teñidas in vivo con IRAZOLVE-MITO se fijaron en formaldehído al 4 % y glutaraldehído al 0,1 % en HEPES 0,1 M durante 15 min o durante la noche. Después del lavado, las células se deshidrataron con series graduadas de acetona seguido de dos lavados en acetona al 100%. Después del secado en el punto crítico, los portaobjetos de cubierta de vidrio se montaron en trozos y se recubrieron durante 10 s con oro (Baltec SCD 050). Las células teñidas y fijadas se secaron opcionalmente al aire o con una bomba rotatoria sin deshidratación.

En un primer momento, tomamos cuatro imágenes consecutivas con los mismos parámetros (4 keV, 15 µs, 300 pA) de células Vero teñidas in vivo con el colorante IRAZOLVE-MITO sin recubrimiento o recubierto de oro (~ 2 nm) usando el detector Crytur CL montado a SEM JEOL 7401F a −140 °C. Las intensidades y la descomposición de CL se analizaron a partir de imágenes utilizando la herramienta Matlab como se muestra en la Fig. S5. FAST-PEAK-FIND39 (Fig. S5A) detectó los centros con las intensidades CL más altas de 25 áreas de la muestra sin recubrimiento y 9 áreas de la muestra recubierta de oro, con un parámetro de umbral igual a 145 determinado manualmente a partir del máximo intensidad de las células en el fondo. Para un análisis más detallado, cortamos cada área con las intensidades CL más altas de la imagen a un área cuadrada de 21 × 21 px (Fig. S5B). Para cada área, determinamos el diámetro del círculo que define la región CL (marcada en rojo en la Fig. S5B) como el máximo de la segunda derivada (marcada en rojo en la Fig. S5D) obtenida de las intensidades promedio calculadas en círculos concéntricos con un creciente diámetro con el centro ubicado en el medio de esta área cuadrada (Fig. S5B, C). La intensidad total de CL se calculó y analizó estadísticamente a partir de esta región interna de CL (Fig. S5E), mientras que las áreas exteriores representaron el fondo (Fig. S5F). Las intensidades de CL se trazaron a lo largo del tiempo (cuatro fotos consecutivas), donde el primer valor representa el 100% (Fig. 5).

La resolución CL simulada para hielo amorfo y energía de haz de 4 keV en una muestra a granel se calculó en Casino 2.540.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

catodoluminiscencia

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Agradecemos a la empresa Crytur por la posibilidad de utilizar su detector CL, Jiří Vaněček (BC CAS) y Marek Dolejší (Universidad de Bohemia del Sur, USB, České Budějovice) por la asistencia técnica experta con el SEM, Eva Výletová (USB) por proporcionarnos humanos células epiteliales de las vías respiratorias, obsequio de R. Randall, Universidad de St. Andrews, Reino Unido. Las sondas de tinción IRAZOLVE-MITO y REZOLVE-ER, comercializadas anteriormente por ReZolve Scientific, fueron proporcionadas amablemente por la Prof. Sally Plush (Universidad de Australia Meridional; [email protected]) y el Prof. Max Massi (de la Universidad de Curtin, Perth, Australia y ReZolve comp., [email protected]); Para consultar sobre la disponibilidad de las sondas y la posible colaboración, comuníquese con Sally Plush y Max Massi utilizando las direcciones de correo electrónico proporcionadas.

Este trabajo fue apoyado por la Agencia de Tecnología de la República Checa (TN0100008), el Ministerio de Educación, Juventud y Deportes de la República Checa (Czech BioImaging LM2018129) y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional-Proyecto "Mecanismos y dinámica de complejos macromoleculares : de moléculas individuales a células" (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000441).

Instituto de Parasitología, Centro de Biología CAS, České Budějovice, 37005, República Checa

Marie Vancová, Eva Ďurinová, Tomáš Bílý & Jana Nebesářová

Facultad de Ciencias, Universidad de Bohemia del Sur, České Budějovice, 37005, República Checa

Marie Vancová, Eva Ďurinová y Tomáš Bílý

Instituto de Instrumentos Científicos CAS, Brno, 612 000, República Checa

Radim Skoupý y Vladislav Krzyžánek

Facultad de Ciencias, Universidad Charles de Praga, Praga, 128 00, República Checa

Jana Nebesářová

CRYTUR, Spol. S RO, Turnov, 511 01, República Checa

Aleš Kolouch y Petr Horodyský

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MV diseñó el experimento, escribió el manuscrito, preparó las muestras y realizó las imágenes de catodoluminiscencia-SEM. RS participó en la imagen de catodoluminiscencia-SEM y realizó una simulación de resolución CL. ED realizó cultivo e imágenes in vivo. TB realizó análisis de imagen. El manuscrito fue escrito a través de las contribuciones de todos los autores. Todos los autores han dado su aprobación a la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Marie Vancová.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Vancová, M., Skoupý, R., Ďurinová, E. et al. Imágenes de catodoluminiscencia de estructuras celulares marcadas con complejos luminiscentes de iridio o renio a temperaturas criogénicas. Informe científico 12, 13432 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17723-w

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Recibido: 09 marzo 2022

Aceptado: 29 de julio de 2022

Publicado: 04 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17723-w

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