Eliminación de meticilina

Military Medical Research volumen 10, Número de artículo: 21 (2023) Citar este artículo

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El tratamiento de las infecciones por biopelícula de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) en la cirugía de colocación de implantes está limitado por la falta de actividad antimicrobiana de los implantes de titanio (Ti). Existe la necesidad de explorar enfoques más efectivos para el tratamiento de las infecciones por biopelículas de MRSA.

En este documento, se propone una estrategia de funcionalización interfacial mediante la integración de nanopartículas de polidopamina mesoporosas (PDA), nitroprusiato de sodio (SNP) liberador de óxido nítrico (NO) y péptido de crecimiento osteogénico (OGP) en implantes de Ti, denominados Ti-PDA@SNP- OGP. Las propiedades físicas y químicas de Ti-PDA@SNP-OGP se evaluaron mediante microscopía electrónica de barrido, espectroscopio fotoelectrónico de rayos X, ángulo de contacto con el agua, propiedad fototérmica y comportamiento de liberación de NO. El efecto antibacteriano sinérgico y la eliminación de las biopelículas de SARM se evaluaron mediante sonda de diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína, ensayo de 1-N-fenilnaftilamina, intensidad de trifosfato de adenosina, actividad de hidrólisis de o-nitrofenil-β-d-galactopiranósido, fuga de ácido bicinconínico. La tinción de fluorescencia, los ensayos de actividad de fosfatasa alcalina, la secreción de colágeno y la mineralización de la matriz extracelular, la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se utilizaron para evaluar la respuesta inflamatoria y la capacidad osteogénica en el estroma de la médula ósea. (MSC), células RAW264.7 y su sistema de cocultivo. Se utilizaron tinción de Giemsa, ELISA, micro-CT, hematoxilina y eosina, tricrómico de Masson y tinción inmunohistoquímica para evaluar la erradicación de biopelículas de MRSA, la inhibición de la respuesta inflamatoria y la promoción de la osteointegración de Ti-PDA@SNP-OGP in vivo.

Ti-PDA@SNP-OGP mostró un efecto antibacteriano dependiente de NO y fototérmico sinérgico contra MRSA después de la irradiación con luz infrarroja cercana, y eliminó efectivamente las biopelículas de MRSA formadas al inducir estrés oxidativo mediado por especies reactivas de oxígeno (ROS), destruyendo la integridad de la membrana bacteriana y provocando fugas de componentes intracelulares (P < 0,01). Los experimentos in vitro revelaron que Ti-PDA@SNP-OGP no solo facilitó la diferenciación osteogénica de las MSC, sino que también promovió la polarización de los macrófagos M1 proinflamatorios al fenotipo M2 antiinflamatorio (P < 0,05 o P < 0,01). El microambiente osteoinmune favorable facilitó aún más la osteogénesis de las MSC y la antiinflamación de las células RAW264.7 a través de múltiples vías de señalización paracrina (P < 0,01). La evaluación in vivo confirmó los resultados antes mencionados y reveló que Ti-PDA@SNP-OGP indujo una mejoría de la osteointegración en un modelo de implantación de defecto femoral infectado con MRSA (P < 0,01).

Estos hallazgos sugieren que Ti-PDA@SNP-OGP es un material multifuncional prometedor para el tratamiento altamente eficiente de infecciones por MRSA en cirugías de reemplazo de implantes.

La infección asociada a biomateriales (BAI) es una carga de salud global que es responsable de aproximadamente el 40% de todas las infecciones hospitalarias en los EE. UU. [1]. Las infecciones ocurren a lo largo de la vida útil de los implantes, pero no solo durante el proceso de implantación, lo que inevitablemente provoca el fracaso de los implantes de titanio (Ti) [2, 3]. La formación de biopelículas de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) en las superficies de los implantes de Ti exacerba la carga de BAI [4]. Las sustancias poliméricas extracelulares (EPS) se presentan en la matriz secretada por MRSA, que puede proteger a las bacterias intramembranosas del sistema inmunitario del huésped y de los desafíos ambientales externos, como la penetración de antibióticos y la presión ambiental [5, 6]. La extracción y el reemplazo de los implantes infectados es a menudo la elección de Hobson en el tratamiento de las infecciones por MRSA asociadas a los implantes debido a la ineficacia de los antibióticos convencionales para eliminar las biopelículas de MRSA [7, 8]. La capacidad de osteointegración posoperatoria menos que ideal de los implantes de Ti reduce aún más su eficacia [9]. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar una estrategia novedosa que elimine simultáneamente las biopelículas de MRSA y mejore la osteointegración de los implantes de Ti sin inducir resistencia a los medicamentos.

La terapia fototérmica (PTT) es un enfoque no intrusivo que se ha explorado ampliamente para eliminar las biopelículas. Este enfoque se caracteriza por una penetración profunda en los tejidos, adaptabilidad de la aplicación, alta selectividad, bajo riesgo de resistencia a los medicamentos y efectos secundarios mínimos [10,11,12]. Los agentes fototérmicos de uso común incluyen nanopartículas metálicas (p. ej., nanopartículas de oro y cobre), moléculas orgánicas (p. ej., porfirina, verde de indocianina, derivados de tiadiazol), materiales a base de carbono (p. ej., óxido de grafeno, nanotubos de carbono, nitruro de carbono) y sulfuros metálicos ( por ejemplo, sulfuro de cobre, sulfuro cuproso, disulfuro de molibdeno) [13,14,15,16,17]. Las nanopartículas de polidopamina (PDA) son agentes fototérmicos prometedores debido a su alta capacidad de conversión fototérmica, excelente biocompatibilidad y factibilidad de modificación [18,19,20]. En un estudio anterior, se informó que los hidrogeles compuestos que comprenden quitosano injertado con ácido láurico, polietilenglicol modificado con dibenzaldehído y nanopartículas de PDA cargadas con curcumina exhiben una potente capacidad antibacteriana contra las infecciones de heridas. Esta actividad se atribuyó al efecto sinérgico entre la luz infrarroja cercana (NIR), la liberación bajo demanda de curcumina y la hipertermia [21]. Sin embargo, las biopelículas solo se erradicaron mediante la aplicación de radiación NIR a 70 °C. Aunque el cuerpo humano puede soportar temperaturas locales relativamente altas durante un breve período de tiempo, los tejidos normales circundantes pueden dañarse en condiciones de alta temperatura [22, 23]. La temperatura suave (~ 5 °C) inducida por PTT produce menos efectos adversos, pero las actividades antibacteriana y anti-biofilm se reducen significativamente a esa temperatura suave [24, 25]. Para abordar este problema, los científicos han combinado la PTT con la aplicación de agentes antibacterianos para inhibir la formación de biopelículas y eliminar las biopelículas establecidas.

La combinación de terapia de gas con PTT es un enfoque auspicioso para mejorar la eficacia de PTT contra infecciones bacterianas, heridas infectadas, inflamación, enfermedades cardiovasculares y cánceres [26,27,28]. El tratamiento de las infecciones bacterianas mediante la terapia con gases implica el uso de un alto volumen de moléculas gaseosas como hidrógeno, sulfuro de hidrógeno, monóxido de carbono, dióxido de carbono, dióxido de azufre y óxido nítrico (NO) [29,30,31,32,33, 34]. El NO es una molécula de gas endógeno importante en procesos fisiológicos y patológicos. La eficacia antibacteriana del NO se atribuye a su efecto dañino sobre las proteínas y las moléculas de ADN en altas concentraciones. El NO posee una potente actividad antibacteriana contra la invasión bacteriana en mamíferos sin causar resistencia a los medicamentos [35, 36]. Sin embargo, el uso de la terapia con gas para el tratamiento de infecciones bacterianas está limitado por la acumulación insuficiente de gas en el sitio infectado, el comportamiento de liberación descontrolada y los mecanismos terapéuticos imprecisos [37, 38]. Hasta la fecha, se han investigado diferentes enfoques de activación de NO. Estos enfoques incluyen glutatión, enzimas, pH, H2O2 y tratamientos fototérmicos. Entre ellos, el PTT es un enfoque prometedor y eficiente debido a su penetración profunda en los tejidos y su comportamiento de liberación controlable de NO bajo irradiación NIR [23]. En consecuencia, existe una necesidad apremiante de desarrollar sistemas de administración de fármacos estimulados por láser NIR con un comportamiento de liberación "bajo demanda" para mejorar la especificidad de la terapia de gas.

Con el desarrollo de la nanotecnología, los diazeniodiolatos (NONOatos), N,N′-disecbutil-N,N′-dinitroso-p-fenilendiamina (BNN6), S-nitrosoglutatión (GSNO) y L-arginina (L-Arg) han sido ampliamente empleados como donantes de NO [23, 28]. Sin embargo, problemas como la toxicidad de los subproductos, la vida media corta, la acumulación insuficiente de gas, el comportamiento de liberación descontrolada y los mecanismos terapéuticos imprecisos debilitan la eficacia terapéutica de estos compuestos in vivo [28]. En comparación, el nitroprusiato de sodio (SNP) es más biocompatible que otros y puede usarse como un donante activado fototérmicamente para la liberación de NO "bajo demanda", debido a su sensibilidad a las altas temperaturas [39, 40].

En este estudio, con el fin de lograr la erradicación de las biopelículas de MRSA y una mejor osteointegración, se propuso una estrategia multifuncional mediante el acoplamiento de la terapia con gas NO, PTT con terapia con fármacos peptídicos en implantes de Ti.

Se obtuvieron varillas de Ti (longitud: 10 mm, diámetro: 15 mm) y láminas de Ti (10 mm × 10 mm, 0,25 mm de espesor) del Instituto del Noroeste para la Investigación de Metales No Ferrosos (Xi'an, China). El clorhidrato de dopamina, el diacetato de fluoresceína, el yoduro de propidio, Pluronic F-127, DCFH-DA, o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) y Hoechst 33258 se adquirieron de MilliporeSigma (St. Louis, MO, EE. UU.). SNP, tris (hidroximetil) animometano (Tris), 1,3,5-trimetilbenceno, polimixina B y N-fenil-1-naftilamina se adquirieron de Aladdin Industrial Co. Ltd. (Shanghai, China). El kit de recuento celular 8 (CCK-8), el caldo Mueller Hinton (MHB), la agarosa y el paraformaldehído se obtuvieron de Solarbio Biotechnology Co. (Beijing, China). Kit de ensayo de ácido bicinconínico (BCA), reactivo de Griess, kit de ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH), kit de tinción de fosfatasa alcalina (ALP) BCIP/NBT, kit de ensayo ALP, kit de tinción de rojo Sirius, sal sódica de rojo de alizarina, trifosfato de adenosina mejorado (ATP) El kit de ensayo, el kit de detección de 3,3'-diaminobencidina (DAB), el kit de tinción con hematoxilina y eosina (HE), el kit de tinción con tricrómico de Masson y el kit de tinción con Giemsa se adquirieron de Beyotime Biotechnology Co. (Jiangsu, China). El péptido de crecimiento osteogénico (OGP, ALKRQGRTLYGFGG) se adquirió de Top‐Peptide Co., Ltd. (Shanghai, China). La rodamina-faloidina, el reactivo Trizol y los cebadores se compraron en Invitrogen Co. (CA, EE. UU.). Kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para el factor de transcripción relacionado con Runt-2 (Runx2), proteína morfogenética ósea-2 (BMP2), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento transformante-β (TGF-β), tumor el factor de necrosis-α (TNF-α), la interleucina-6 (IL-6) y la IL-10 se adquirieron de ABclonal Biotechnology. Co., Ltd. (Wuhan, China). Se compraron otros productos químicos a Xingguang Chemical Co. (Chongqing, China).

Pluronic F-127 (0,36 g) y 1,3,5-trimetilbenceno (0,36 g) se mezclaron y disolvieron en una mezcla de H2O (65 ml) y etanol (60 ml). Se añadieron Tris (90 mg) y clorhidrato de dopamina (60 mg) y se agitaron durante 24 h en condiciones de oscuridad. La plantilla y el PDA se eliminaron por centrifugación. El PDA se lavó tres veces con la mezcla de etanol y acetona. Las nanopartículas de PDA sintetizadas se dispersaron en etanol y se almacenaron a -20 °C para su posterior análisis.

Las nanopartículas de PDA@SNP se prepararon dispersando nanopartículas de PDA (5 mg) en etanol. Se introdujo una solución de SNP preparada previamente (2,5 mg/ml) en condiciones de agitación. La mezcla negra se recogió por centrifugación (11 000 r/min, 10 min) después de 24 hy las nanopartículas de PDA@SNP se enjuagaron con agua desionizada.

Las nanopartículas de PDA@SNP se sumergieron en tampón Tris-HCl (10 mmol/L, pH 8,5) que contenía OGP (2 mg/ml) para garantizar la inmovilización covalente de las OGP. Después de agitar la mezcla durante 24 h, las nanopartículas de PDA@SNP-OGP se recolectaron y se enjuagaron con agua desionizada. La morfología de PDA, PDA@SNP y PDA@SNP-OGP se analizó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM, Talos F200S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). La cantidad total de OGP conjugada en las nanopartículas PDA@SNP se determinó mediante un espectrofotómetro ultravioleta-visible (UV-Vis) (UV-3600, Shimadzu, Japón).

Se empaparon láminas de Ti limpias en solución de clorhidrato de dopamina (2 mg/ml) que contenía tampón Tris 10 mmol/L (20 ml, pH 8,5) y se incubaron durante 24 h. Posteriormente se inmovilizaron nanopartículas de PDA, PDA@SNP o PDA@SNP-OGP (0,3 mg) sobre sustrato de Ti a través del recubrimiento de dopamina. Las muestras se enjuagaron con agua desionizada y se denominaron Ti-PDA, Ti-PDA@SNP o Ti-PDA@SNP-OGP. La morfología, la química superficial y los ángulos de contacto con el agua (WCA) de estos sustratos se analizaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM, Quattro S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS, Empyrean, Países Bajos) y goniometría de ángulo de contacto (SDC-200S, Sindin, China), respectivamente. La imagen de la sección transversal y el grosor del recubrimiento de PDA@SNP-OGP en el implante de Ti se observaron mediante SEM. La fuerza de adhesión del revestimiento se investigó utilizando un probador de rayado (CSM Instruments, Suiza).

El efecto fototérmico de las nanopartículas preparadas se evaluó utilizando radiación NIR emitida por un láser de 808 nm (Mild-River Company, China). Los cambios de temperatura en tiempo real se registraron utilizando un termómetro digital (HH806AU, Omega Engineering, Norwalk, CT, EE. UU.). Brevemente, las nanopartículas de PDA, PDA@SNP y PDA@SNP-OGP (0,5 mg/ml) se expusieron a un láser de 808 nm (1,00 W/cm2) durante 10 min. La eficacia de conversión fototérmica (η), las curvas de calentamiento y enfriamiento de las nanopartículas PDA, PDA@SNP y PDA@SNP-OGP (0,5 mg/ml) se evaluaron de acuerdo con las siguientes ecuaciones:

donde Tmax es la temperatura máxima inducida por las muestras (nanopartículas PDA, PDA@SNP o PDA@SNP-OGP), Tmax,agua es la temperatura máxima del agua, Tsurr es la temperatura ambiente de la habitación. Q0 es la entrada de energía de fondo sin especímenes y se calcula a partir de la ecuación. (3). I es la potencia del láser (1 W/cm2), A808 es la absorbancia de la muestra (nanopartículas PDA, PDA@SNP y PDA@SNP-OGP) a 808 nm, h es el coeficiente de transferencia de calor, S es el área de superficie del recipiente de la muestra , md es el peso de la solución de nanopartículas PDA, PDA@SNP o PDA@SNP-OGP, y cd es la capacidad calorífica del agua.

El efecto fototérmico del sustrato de Ti nativo o de Ti funcionalizado se evaluó utilizando un sistema de imagen térmica infrarroja (sistema de imagen E40 IR, FLIR, Wilsonville, OR, EE. UU.). Ti se empapó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (500 μl) y se expuso a radiación NIR (1,00 W/cm2, 10 min). Se registraron los cambios de temperatura de cada espécimen y el intervalo de tiempo se fijó en 30 s. Además, se evaluaron los cambios de temperatura del Ti-PDA@SNP-OGP irradiado con diferentes densidades de potencia NIR (0,25, 0,50, 1,00 y 1,25 W/cm2).

Se utilizó reactivo de Griess para determinar el nivel de NO. Ti-PDA@SNP-OGP se expuso a NIR (1,00 W/cm2) durante 10 min, seguido de 20 min sin irradiación NIR, y este procedimiento se repitió 5 veces. El medio resultante se trató con reactivo de Griess (50 µl). La cantidad de NO liberado de Ti-PDA@SNP-OGP se determinó a 548 nm usando un espectrofotómetro UV-Vis. También se evaluaron los perfiles de liberación acumulativa de NO de Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP y Ti-PDA@SNP-OGP. La concentración de NO liberado se calculó usando una curva estándar.

Se utilizó MRSA (ATCC33591) para evaluar la propiedad antibiopelícula. Los especímenes se cultivaron con 1 ml de suspensión de MRSA [1 × 108 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml] en la fase de crecimiento estacionario a 37 °C durante 3 días, y el medio de cultivo MHB se reemplazó todos los días. La propiedad y el mecanismo antibiopelícula se determinaron mediante el ensayo de placa extendida, el examen SEM, la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), la permeabilidad de la membrana, la intensidad de ATP y la hidrólisis de ONPG con o sin irradiación NIR.

Para la actividad antibiopelícula, las muestras se cultivaron con 1 ml de suspensión de MRSA (1 × 108 CFU/ml) en la fase de crecimiento estacionario y se incubaron a 37 °C durante 3 días. A continuación, las muestras se expusieron a radiación NIR (1,00 W/cm2) durante 10 min. Las bacterias no adheridas se separaron lavando suavemente con PBS. Se añadió un mililitro de PBS estéril a cada pocillo y el MRSA tratado se eliminó de los sustratos mediante ultrasonidos durante 10 min. La suspensión bacteriana se diluyó 10.000 veces con PBS estéril. Luego, se extendieron 100 μl de suspensión bacteriana diluida sobre las placas de agar. Se tomaron imágenes de las UFC y se contaron. La relación antibacteriana de cada sustrato se calculó mediante la fórmula: A = (B – C)/B × 100 %; donde A es la relación antibacteriana, B es la UFC promedio del grupo control (Ti) y C es la UFC promedio del grupo experimental.

La biopelícula de MRSA se cultivó en sustrato de Ti o de Ti funcionalizado con o sin irradiación NIR durante 10 min. Los biofilms fueron despojados por ultrasonido para generar una suspensión bacteriana. La suspensión se añadió a una oblea de silicio y se fijó durante la noche con paraformaldehído (4% en peso) a 4 °C. Las muestras se deshidrataron con una serie ascendente de etanol (25 %, 50 %, 75 % y 100 %) y luego se deshidrataron con terc-butanol durante 10 min. Las muestras secas se recubrieron con oro para el examen SEM.

La generación de ROS en los diferentes grupos se evaluó mediante una sonda de diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína (DCFH-DA). Se cultivó una suspensión de MRSA (1 ml, 1 × 106 CFU/ml) en Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP o Ti-PDA@SNP-OGP, con/sin irradiación láser NIR de 808 nm. La suspensión bacteriana se incubó durante 24 h y se trató con solución DCFH-DA (10 μm). Después de incubar las muestras durante 30 min, se determinó la intensidad de la fluorescencia utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia (RF5301PC, Shimadzu, Kyoto, Japón) con una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 525 nm.

Se utilizó un método de sonda fluorescente de 1-N-fenilnaftilamina (NPN) para examinar la permeabilidad de la membrana de MRSA. Se obtuvo una suspensión de MRSA por centrifugación (5000 r/min, 8 min) y se trató con la sonda fluorescente NPN (10 μl, 10 μmol/L) durante 30 min. La intensidad de fluorescencia de la solución se determinó usando un espectrofotómetro de fluorescencia (longitud de onda de excitación 350 nm, longitud de onda de emisión 420 nm). Se usó una suspensión de MRSA tratada con polimixina B como control positivo. Las intensidades de fluorescencia de los grupos experimentales se normalizaron a las del grupo de control (Ti sin irradiación NIR).

El ensayo BCA se realizó para investigar la pérdida de proteínas de MRSA después de varios tratamientos. Se sembró MRSA (1 ml, 1 × 106 CFU/ml) sobre Ti, Ti-PDA, Ti-MPDA@SNP o Ti-PDA@SNP-OGP. Posteriormente, se recolectó el medio de cultivo y se agitó durante 20 s. Luego, se extrajo la mezcla (400 μl), se filtró con un filtro de jeringa (0,22 μm). A continuación, la muestra de filtrado (25 μl) se añadió al kit de ensayo de proteínas BCA estándar y se incubó a 37 °C con agitación suave (200 r/min). Por último, la absorbancia de la solución obtenida se determinó a 490 nm utilizando un lector espectrofotométrico de microplacas (Bio-Rad 680, Hercules, CA, EE. UU.). La cantidad de fuga de proteína = (la cantidad de proteína en cada grupo experimental − la cantidad de proteína en el grupo de control). El medio LB con Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP y Ti-PDA@SNP-OGP sin agregar MRSA se usó como grupo de control, y el medio LB con Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP y Ti-PDA @ SNP-OGP con la adición de MRSA se utilizó como grupos experimentales.

Se usó un kit de ensayo de ATP para evaluar la intensidad de ATP de MRSA en diferentes condiciones. Se sembró MRSA (1 ml, 1 × 106 CFU/ml) sobre Ti, Ti-PDA, Ti-MPDA@SNP o Ti-PDA@SNP-OGP. La mitad de las muestras de cada grupo se expusieron a radiación NIR mientras que la otra mitad no se irradió. Las intensidades de ATP se evaluaron utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia a 562 nm. La intensidad de fluorescencia relativa de los grupos experimentales se obtuvo normalizando la intensidad de fluorescencia a la del Ti prístino sin irradiación NIR (grupo de control).

Se llevó a cabo la hidrólisis de ONPG para evaluar la permeabilidad de la membrana de las bacterias presentes en las biopelículas de MRSA. Las biopelículas de MRSA se trataron con/sin irradiación 808 NIR durante 10 min. Las biopelículas que crecieron en los diferentes sustratos se recolectaron mediante sonicación (10 min) y se incubaron con solución de ONPG (500 μl, 0,75 mol/L). Los valores de densidad óptica de los sobrenadantes se determinaron a 405 nm utilizando un lector de microplacas espectrofotométrico (Bio-Rad 680, Hercules, CA, EE. UU.).

Para la actividad deshidrogenasa de la cadena respiratoria, MRSA (1 ml, 1 × 106 CFU/ml) se incubó con Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP y Ti-PDA@SNP-OGP con/sin irradiación láser a 37 ° C durante 12 h. Luego, el medio de cultivo (250 μl), solución de glucosa (1 ml, 100 mmol/L), tampón tris (hidroximetil) aminometano (TRIS) (1 ml, 50 mmol/l, pH = 8,6), 4% 2, Se añadieron a un tubo solución de cloruro de 3,5-trifeniltetrazolio (TTC) y caldo LB (250 µl). Después de incubar durante 6 h, se añadió ácido sulfúrico concentrado (50 μl) a la mezcla anterior para detener la reacción. Posteriormente, el producto de reacción enzimática formado [1,3,5-trifenilformazán (TPF)] se extrajo con tolueno. Por último, la absorbancia de la solución obtenida se determinó a 490 nm utilizando un lector espectrofotométrico de microplacas (Bio-Rad 680, Hercules, CA, EE. UU.). La actividad relativa de la deshidrogenasa de la cadena respiratoria (%) se calculó según la siguiente fórmula: A = B/C × 100%. Donde A indica la actividad relativa de la deshidrogenasa de cadena respiratoria; B es el valor promedio de OD490 del control (Ti sin irradiación NIR); y C es el valor promedio de OD490 de las muestras experimentales.

La fuga de componentes intracelulares como indicador para la evaluación de la integridad de la membrana en bacterias se midió mediante el enfoque OD260. Se cultivó 1 ml de MRSA (5 × 108 CFU/ml) con sustratos Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP y Ti-PDA@SNP-OGP. La mitad de las muestras de cada grupo se expusieron a radiación NIR mientras que la otra mitad no se irradió. Posteriormente, la mezcla se filtró con un filtro de jeringa (0,22 μm) para eliminar las bacterias y otros materiales. Por último, la absorbancia de la solución obtenida se determinó a 260 nm mediante un espectrofotómetro UV-Vis (UV-3600, Shimadzu, Japón).

Se aislaron células del estroma de la médula ósea (MSC) de las tibias y el fémur de diez ratas Sprague-Dawley (SD) (macho, 100-120 g) como se informó anteriormente [41,42,43]. Las ratas SD fueron proporcionadas por la Universidad Médica de Chongqing y el número de licencia de producción para animales de experimentación fue SCXK 2022-0010. El medio se cambió cada 2 días y las MSC del tercer paso se usaron en los experimentos posteriores. Se cultivaron células RAW264.7 (Universidad Médica del Ejército, Chongqing, China) en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa suplementado con estreptomicina/penicilina y suero bovino fetal al 10 % (v/v) (Hyclone, EE. UU.) por debajo del 5 %. CO2 a 37 °C.

Se incubaron MSC óseas (1 × 104 células/pocillo) o células RAW264.7 (1 × 104 células/pocillo) con diferentes sustratos durante 2 días [20]. Luego, las células se lisaron con Triton X-100 (0, 2%) durante 5 minutos y se trataron con una solución de rodamina-faloidina durante la noche para la tinción del citoesqueleto. Después de la tinción, las muestras se enjuagaron con PBS y los núcleos de células MSC o RAW264.7 se tiñeron con Hoechst 33258 (200 μl).

Los cambios morfológicos en las células MSC o RAW264.7 se evaluaron mediante un microscopio de barrido láser confocal (CLSM; FV3000, Olympus, Tokio, Japón).

Después de la incubación durante 1, 4 o 7 días, se añadió una mezcla de solución CCK-8 y medio de cultivo (1:9, v/v) a los pocillos de cada grupo. Los valores de densidad óptica de los sobrenadantes se determinaron después de la incubación durante 2 h utilizando un lector de microplacas espectrofotométricas a 450 nm. Las células RAW264.7 se cultivaron en diferentes sustratos durante 1, 3 y 5 días. El ensayo CCK-8 se realizó para evaluar la proliferación celular.

Las células cultivadas en diferentes sustratos durante 7 días se analizaron utilizando un kit ALP. Las MSC óseas cultivadas en diferentes sustratos se tiñeron con solución de rojo Sirius durante 2 h. Las células teñidas se trataron con NaOH para disolver los cristales rojos. Los valores de densidad óptica de los sobrenadantes se midieron a 540 nm utilizando un lector espectrofotométrico de microplacas.

Se incubaron MSC adicionales durante 21 días y se tiñeron con rojo de alizarina (0,1 %) para evaluar el nivel de mineralización de la matriz extracelular (MEC).

Los nódulos minerales teñidos se disolvieron con solución de CH3COOH (10%) y los valores de densidad óptica de los sobrenadantes se determinaron a 405 nm utilizando un lector de microplacas.

Las células RAW264.7 (5 × 104 células/ml) se activaron añadiendo una solución de lipopolisacárido (LPS) (40 ng/ml) al medio para estimular la polarización de los macrófagos en el tipo M1, seguido de una incubación conjunta con diferentes sustratos. Tras 24 h de cultivo, se evaluó la actividad antiinflamatoria en función de los niveles de expresión de genes representativos de tipo M1 [CD86, óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y CD11C], tipo M2 [CD206, arginasa-1 (Arg -1) y CD163], citoquinas proinflamatorias (TNF-α e IL-1β) y citoquinas antiinflamatorias (IL-10 e IL-1ra).

Se cultivaron MSC óseas o células RAW264.7 en placas de 24 pocillos con diferentes sustratos. El ARN total se extrajo de MSC o células RAW264.7 utilizando el kit Total RNA (Qiagen, Hilden, Alemania). El ARN se transcribió inversamente en ADN complementario utilizando un kit de transcripción inversa (Takara, Shiga, Japón). Se utilizó un sistema Bio-Rad CFX Manager para qRT-PCR, y los cebadores utilizados se enumeran en el Archivo adicional 1: Tabla S1. Los niveles relativos de expresión génica se obtuvieron normalizando los niveles de expresión al nivel del gen de limpieza β-actina.

Las concentraciones de TNF-α, IL-1β, IL-10 e IL-6 secretadas por células RAW264.7 sembradas en diferentes sustratos se determinaron utilizando kits ELISA. Se cultivaron células RAW264.7 (5 × 104 células/ml) en diferentes sustratos y se incubaron durante 3 días. Las muestras se centrifugaron, se recogieron los sobrenadantes y se determinaron las concentraciones de citoquinas usando curvas estándar.

Se realizó un experimento de cocultivo de Transwell para evaluar la diferenciación osteogénica de las MSC bajo la influencia de las células RAW264.7. Se sembraron MSC óseas (1 × 104 células/pocillo) en la cámara Transwell superior (Corning, Nueva York, EE. UU.; tamaño de poro: 8 μm, diámetro interior: 6,5 mm) y se cocultivaron con células RAW264.7 durante 24 h [41]. Las MSC que migraron a través de la membrana se fijaron con paraformaldehído al 4 % y se tiñeron con reactivo cristal violeta al 1 %. Las MSC teñidas se analizaron usando un microscopio invertido (Zeiss, Jena, Alemania).

Las células RAW264.7 (1 × 104 células/pocillo) se cultivaron en sustrato Ti o Ti funcionalizado durante 2 días. El medio acondicionado con la muestra se recogió y centrifugó (1000 r/min, 4 min) para eliminar las células residuales. A continuación, las MSC se cultivaron en placas de 24 pocillos con la adición del medio condicional (1 ml) de cada grupo. El medio acondicionado con la muestra se cambió cada 2 días. Las células se trataron con reactivos de tinción de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP)/nitro azul tetrazolio (NBT), rojo Sirius y rojo S de alizarina en un tiempo predeterminado. Se evaluaron los niveles de expresión de ARNm de genes relacionados con la osteogénesis (Runx2, BMP2, ALP, OPN y OCN).

Todos los experimentos con animales in vivo se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales y las regulaciones relevantes para la experimentación con animales de laboratorio de la Universidad Médica de Chongqing y el Séptimo Centro Médico del Hospital General PLA, y fueron aprobados por los Comités de Ética Animal de la Universidad Médica de Chongqing (2021- 738) y el Séptimo Centro Médico del Hospital General PLA (2021-110). Se proporcionaron cuarenta ratas SD (macho, 200-250 g) de la Universidad Médica de Chongqing y se usaron para la cirugía de implantación. Las ratas fueron anestesiadas y el área quirúrgica fue rasurada y desinfectada. Se construyó con éxito un modelo de defecto femoral infectado con SARM haciendo un defecto cilíndrico (1,5 mm de diámetro) utilizando un taladro quirúrgico en el centro del cóndilo femoral en dirección a la cavidad medular. Los sitios quirúrgicos se suturaron después de insertar suavemente los implantes de Ti preparados con biopelículas de MRSA formadas en los defectos óseos. El sitio de implantación se expuso a radiación NIR (1,00 W/cm2) durante 10 min y los cambios de temperatura en tiempo real se registraron con una cámara térmica.

Se sacrificaron ratas para recoger las muestras de fémur 3 días después de la implantación, y se retiraron suavemente los implantes incrustados. Los implantes se empaparon en MHB y se sometieron a ultrasonidos para eliminar el MRSA adherido. La suspensión bacteriana se cultivó durante 12 h, se diluyó (10.000 veces) y se inoculó en placas de agar MHB. Se investigó la eficacia antibiopelícula de cada muestra. Las colonias de bacterias en las placas se evaluaron y fotografiaron después de cultivarlas a 37 °C durante 24 h. Los implantes se empaparon en medio MHB y se cultivaron durante 14 h. Se fotografió la turbidez de cada grupo y se determinó el nivel de turbidez. Mientras tanto, se realizó ELISA para determinar las concentraciones de TNF-α, IL-6, TGF-β e IL-10. Además, se realizaron tinciones de HE e inmunohistoquímica (IHC) utilizando anticuerpos anti-CD68 y anti-CD206 para investigar el efecto osteoinmunomodulador [42]. Las secciones de tejido óseo se desparafinaron, se hidrataron en una serie descendente de etanol (100–50 %), se recuperaron los antígenos, se bloquearon durante 30 minutos y se incubaron con anticuerpos primarios (CD86 y CD206) durante la noche a 4 °C. Luego, las secciones se trataron con los correspondientes anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante a temperatura ambiente durante 1 h, luego se tiñeron con un kit de detección DAB para la reacción de color y se contratiñeron con hematoxilina.

Las ratas se sacrificaron 30 días después de la implantación para examinar el grado de osteointegración entre los implantes y los tejidos óseos originales. Los análisis se realizaron mediante microtomografía computarizada (micro-CT; Viva CT40, SCANCO Medical AG, Brüttisellen, Suiza), HE y tinción tricrómica de Masson. Para micro-CT, los fémures recolectados se fijaron con reactivo de formalina y se incubaron durante 2 días. Los fémures tratados se escanearon con micro-CT y se analizaron como se describió anteriormente [42]. Para la tinción tricrómica de HE y Masson, los implantes se extrajeron suavemente de los fémures y se tiñeron. Los especímenes teñidos se observaron usando un microscopio invertido (Zeiss). La bioseguridad también se evaluó mediante análisis bioquímicos de sangre entera.

Todos los datos se presentaron como media ± desviación estándar (DE). Los datos se procesaron en el software Origin (versión 8.0) mediante la prueba de Tukey a través del análisis de varianza (ANOVA) unidireccional para el análisis estadístico. La significación estadística se preestableció en α = 0,05.

Como se muestra en la Fig. 1a, el PDA mostró una morfología esférica bien dispersa con un diámetro promedio de (176 ± 12) nm. Los diámetros promedio de PDA @ SNP y PDA @ SNP-OGP aumentaron ligeramente a (183 ± 18) nm y (196 ± 21) nm después de la carga de la modificación SNP y OGP, respectivamente. El mapeo elemental TEM mostró que el hierro (Fe) se distribuyó uniformemente en PDA @ SNP-OGP (Fig. 1b). La dispersión de luz diferencial mostró que el tamaño de PDA@SNP-OGP era relativamente más grande que los tamaños de PDA y PDA@SNP (Archivo adicional 1: Fig. S1a), lo cual es consistente con las imágenes TEM. Según los resultados de la espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), las bandas de absorción a 1125 y 840 cm−1 se atribuyeron a υ-NH y υ-Ar del anillo de benceno. Los picos de absorción de PDA@SNP a 2102 y 1885 cm−1 correspondieron a υ-CN (ligandos CN axiales y ecuatoriales) y υ-NO, lo que indica que SNP se cargó con éxito en PDA. Las bandas υ-CN y υ-NO de SNP, y las bandas υ-NH2 y υ-CONH de OGP se observaron después de la modificación con OGP (Archivo adicional 1: Fig. S1b). Según la curva estándar preparada previamente [40], la tasa de carga de SNP de PDA@SNP fue del 8,92 %, utilizando los espectros de espectroscopia de luz UV-Vis (Archivo adicional 1: Fig. S1c).

Caracterización de Ti-PDA@SNP-OGP. a Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de nanopartículas PDA, PDA@SNP o PDA@SNP-OGP. Barra de escala = 100 nm. b Mapeos elementales de nanopartículas PDA y PDA@SNP-OGP. Barra de escala = 100 nm. c Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP o Ti-PDA@SNP-OGP. Barra de escala = 1 μm. d Ángulos de contacto con el agua (WCA) de Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP y Ti-PDA@SNP-OGP. e Curvas de calentamiento de Ti-PDA@SNP-OGP usando irradiación NIR con diferentes intensidades de potencia. f Curvas de calentamiento de Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP o Ti-PDA@SNP-OGP con irradiación NIR (808 nm, 1,00 W/cm2). g Las concentraciones acumuladas de NO de Ti-PDA@SNP o Ti-PDA@SNP-OGP con o sin irradiación NIR (808 nm, 1,00 W/cm2) durante 10 min. **P < 0,01; Titanio, nanopartículas de polidopamina PDA, nitroprusiato de sodio SNP, péptido de crecimiento osteogénico OGP, NO óxido nítrico, luz infrarroja cercana NIR

SEM se utilizó para examinar las morfologías de Ti o sustrato de Ti funcionalizado. Ti tenía una superficie relativamente lisa (Fig. 1c). El PDA, PDA @ SNP y PDA @ SNP-OGP se distribuyeron uniformemente en Ti sin una diferencia obvia en la morfología. Mapeos elementales de la distribución de Ti, O, C, N y Fe en Ti-PDA@SNP-OGP. El análisis XPS de Ti identificó señales de Ti (88,92%) y O (11,08%). En cuanto a Ti-PDA @ SNP-OGP, se identificaron tres nuevos picos (C, N y Fe) (Archivo adicional 1: Fig. S1d). Los espectros C 1 s de Ti-PDA@SNP-OGP mostraron que los picos principales se concentraron en las siguientes ubicaciones: C=O (287,7 eV), C−O (286,3 eV), C−N (285,4 eV), C −C (284,6 eV), y C=C (284,1 eV). Se atribuyeron dos picos de O 1 s a 532,9 y 531,0 eV a O−C y O=C. En el espectro de alta resolución N 1 s de Ti-PDA@SNP-OGP, se asignaron cuatro subpicos en 399,8, 399,2, 398,9 y 398,2 eV a –NH2, –N=O, –N=C, N− C, respectivamente (Archivo adicional 1: Fig. S1e). Estos resultados son indicativos de la modificación realizada por OGP en PDA@SNP-OGP. Ti fue más hidrófobo con un WCA de (60,0 ± 5,6)°. Los WCA de Ti-PDA, Ti-PDA@SNP y Ti-PDA@SNP-OGP fueron (35,0 ± 4,2)°, (32,4 ± 5,0)° y (37,7 ± 4,8)°, respectivamente (Fig. 1d). Se mostró la imagen SEM de la sección transversal de un recubrimiento de PDA@SNP-OGP sobre Ti. El grosor del recubrimiento en Ti varió de 3,7 a 8,3 μm (Archivo adicional 1: Fig. S2a). La fuerza de adhesión de los recubrimientos PDA@SNP-OGP sobre Ti se midió utilizando un probador de rayado (CSM Instruments, Suiza). Las cargas críticas (Lc1 y Lc2) de Ti-PDA@SNP-OGP fueron de aproximadamente 1,14 y 1,26 N, respectivamente (Archivo adicional 1: Fig. S2b). Los datos sugirieron una buena estabilidad mecánica del recubrimiento PDA@SNP-OGP después de que se aplicó a Ti. Esta observación fue consistente con el resultado de un estudio previo [4].

El sistema de imágenes fototérmicas NIR digital se utilizó para evaluar el efecto fototérmico de Ti-PDA @ SNP-OGP a diferentes intensidades de potencia NIR. Después de la irradiación por 10 min (Fig. 1e). Los cambios de temperatura se evaluaron adicionalmente para Ti o sustrato de Ti funcionalizado utilizando potencia de irradiación (1,00 W/cm2). La temperatura de Ti aumentó de 25,0 a 33,7 °C después de la irradiación durante 10 min. Sin embargo, las temperaturas para Ti-PDA, Ti-PDA@SNP y Ti-PDA@SNP-OGP aumentaron a 52,8, 52,0 y 52,1 °C, respectivamente (Fig. 1f). Se encontró que la eficacia de conversión fototérmica (η) de Ti-PDA@SNP-OGP era del 20,3 % después de la exposición a la radiación NIR (Archivo adicional 1: Fig. S2c). La morfología de Ti-PDA@SNP-OGP no cambió después de la irradiación NIR (1,00 W/cm2, 10 min) (Archivo adicional 1: Fig. S2d).

Las concentraciones acumuladas de NO liberado de Ti-PDA@SNP y Ti-PDA@SNP-OGP fueron (15,9 ± 1,2) μmol/L y (15,1 ± 1,1) μmol/L después de la irradiación NIR después de 10 min, respectivamente. Sin embargo, la concentración acumulada de NO liberado de Ti-PDA@SNP o Ti-PDA@SNP-OGP no aumentó sin la irradiación NIR (Fig. 1g). La concentración acumulada de NO liberado de Ti-PDA@SNP-OGP irradiado con NIR aumentó significativamente (P < 0,01, Archivo adicional 1: Fig. S2e), alcanzando (34,6 ± 2,4) μmol/L después de 30 min (Archivo adicional 1 : Fig. S2f), que genera un modo de interruptor de "encendido-apagado" activado por NIR para liberación NO (archivo adicional 1: Fig. S2g). Sin embargo, la concentración acumulada de NO liberado del Ti-PDA@SNP-OGP después de la incubación durante 72 h fue solo (4,9 ± 0,8) μmol/L sin irradiación NIR (Archivo adicional 1: Fig. S2h).

Se utilizó un enfoque de placas de extensión por dilución para investigar la inhibición y erradicación de biopelículas de MRSA en Ti o sustrato de Ti funcionalizado con o sin irradiación NIR. Todos los sustratos no demostraron propiedades bacteriostáticas obvias contra las colonias de MRSA sin irradiación NIR. Por el contrario, el número de colonias de MRSA formadas en las placas de agar en Ti-PDA@SNP o Ti-PDA@SNP-OGP disminuyó notablemente en comparación con el de Ti después de la irradiación NIR (Fig. 2a). Después de 10 min de irradiación NIR, las tasas de eliminación de biopelículas de MRSA por Ti-PDA, Ti-PDA@SNP y Ti-PDA@SNP-OGP fueron (62,4 ± 7,6) %, (98,7 ± 2,6) % y (97,6 ± 4,7)%, respectivamente (Fig. 2b). Según las imágenes SEM, el MRSA exhibió una estructura de membrana esférica e integrada en Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP o Ti-PDA@SNP-OGP sin irradiación NIR. Después de la irradiación NIR, las biopelículas de MRSA se destruyeron parcialmente en Ti-PDA, con membranas celulares marchitas y dañadas (indicadas por flechas rojas). Después de la irradiación NIR, la morfología de las biopelículas de MRSA en Ti aún era uniforme y compacta. Por el contrario, se eliminaron las biopelículas de MRSA y la mayoría de las bacterias estaban muertas con márgenes no enfocables en Ti-PDA@SNP o Ti-PDA@SNP-OGP (Fig. 2c).

Actividad antibiopelícula in vitro de Ti-PDA@SNP-OGP con o sin irradiación NIR. a. Imágenes representativas de colonias de MRSA en placas de agar de cada grupo con o sin irradiación NIR. b Eficacia de eliminación de biopelículas de MRSA según los resultados de las placas de agar en cada grupo. c Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de biopelículas de MRSA de cada grupo con o sin irradiación NIR. Barra de escala = 2 μm. Las flechas rojas indican las membranas celulares dañadas. d Intensidad ROS FL de MRSA de cada grupo por sonda DCFH-DA bajo irradiación NIR. e Intensidad FL relativa de MRSA en diversas condiciones mediante sonda fluorescente NPN, se usó polimixina B como control positivo. Las intensidades de fluorescencia de los grupos experimentales se normalizaron a las del Ti prístino sin irradiación NIR. f Intensidad relativa de ATP de MRSA en cada grupo medida con un espectrofotómetro de fluorescencia. La intensidad de fluorescencia relativa de los grupos experimentales se obtuvo normalizando la intensidad de fluorescencia a la del Ti prístino sin irradiación NIR. g Hidrólisis ONPG de MRSA de cada grupo utilizando un lector de microplacas espectrofotométricas. **P < 0,01; Titanio titanio, nanopartículas de polidopamina PDA, nitroprusiato de sodio SNP, péptido de crecimiento osteogénico OGP, luz infrarroja cercana NIR, escaneo de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina MRSA, especies reactivas de oxígeno ROS, diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína DCFH-DA, NPN 1- N-fenilnaftilamina, fluorescencia FL, ATP trifosfato de adenosina, ONPG o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido

Las biopelículas de MRSA se tiñeron de color púrpura oscuro en Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP o Ti-PDA@SNP-OGP sin irradiación NIR (Archivo adicional 1: Fig. S3a). Después de la irradiación NIR, la tinción en Ti-PDA @ SNP y Ti-PDA @ SNP-OGP se volvió más brillante y la biomasa de biopelícula fue 0.31 y 0.37, respectivamente (P < 0.01, Archivo adicional 1: Fig. S3b). La biomasa del biofilm disminuyó al 68,9 % y al 72,3 % después de 2 min de irradiación NIR en Ti-PDA@SNP y Ti-PDA@SNP-OGP, respectivamente. Cuando las biopelículas de MRSA se irradiaron durante períodos más largos (más de 10 min), la biomasa de la biopelícula en Ti-PDA@SNP y Ti-PDA@SNP-OGP se redujo al 8,1 % y al 13,3 %, respectivamente (Archivo adicional 1: Fig. S3c) . La capacidad antibiopelícula del antibiótico vancomicina se comparó además con los efectos logrados usando Ti o Ti-PDA@SNP-OGP irradiado con NIR. La viabilidad de MRSA de la vancomicina fue del 29,6 %, que fue significativamente mayor que la del Ti-PDA@SNP-OGP irradiado con NIR (8,3 %) (P < 0,01, Archivo adicional 1: Fig. S3d). Además, la biomasa relativa del biofilm en Ti-PDA@SNP-OGP irradiado con NIR fue significativamente menor (10,4 %) que la de Ti (100,0 %) y la vancomicina (95,6 %, P < 0,01, Archivo adicional 1: Fig. S3e) . En conjunto, estos resultados indican que la hipertermia y la liberación de NO activada por fototermia por Ti-PDA@SNP-OGP mostraron un efecto antibacteriano sinérgico contra MRSA y podrían erradicar eficazmente las biopelículas de MRSA.

El nivel de ROS se investigó utilizando una sonda DCFH-DA. Después de la irradiación NIR, los niveles de ROS son mucho más altos en Ti-PDA @ SNP o Ti-PDA @ SNP-OGP, en comparación con Ti o Ti-PDA (P <0.01; Fig. 2d). En comparación, todos los grupos tenían niveles similares de ROS en ausencia de irradiación NIR (Archivo adicional 1: Fig. S3f). Sin irradiación NIR, la intensidad FL relativa de Ti-PDA, Ti-PDA@SNP y Ti-PDA@SNP-OGP obviamente no aumentó en comparación con el grupo Ti. Bajo la irradiación con láser, las intensidades relativas de FL de Ti-PDA @ SNP y Ti-PDA @ SNP-OGP mejoraron significativamente, que fueron similares al control positivo (P <0.01, Fig. 2e). En comparación con Ti, Ti-PDA@SNP-OGP tuvo una disminución más pronunciada en la intensidad de ATP (~63,5%) (Fig. 2f) y una extensión más exhaustiva de fuga de BCA (~2,6 veces) después de la irradiación NIR (Archivo adicional 1: Figura S3g). En contraste, solo hubo una disminución del 30,5% en la intensidad de ATP (Fig. 2f) y un aumento de 1,75 veces en la fuga de BCA en Ti-PDA irradiado con NIR (Archivo adicional 1: Fig. S3g). Se usó la hidrólisis de ONPG para examinar la extensión del daño de la membrana bacteriana (es decir, la extensión de la hidrólisis de ONPG aumenta cuando las membranas bacterianas están dañadas). Sin irradiación NIR, las diferencias en el grado de hidrólisis de ONPG en Ti-PDA, Ti-PDA@SNP y Ti-PDA@SNP-OGP fueron insignificantes en comparación con Ti. Después de la irradiación NIR, el grado de hidrólisis de ONPG en Ti-PDA @ SNP o Ti-PDA @ SNP-OGP fue significativamente mayor que en Ti o Ti-PDA (P <0.01, Fig. 2g). Además, la actividad deshidrogenasa de la cadena respiratoria se midió después de diferentes tratamientos. La deshidrogenasa de la cadena respiratoria se inactivó en Ti-PDA @ SNP o Ti-PDA @ SNP-OGP después de la irradiación NIR (P <0.01, Archivo adicional 1: Fig. S3h). Las alteraciones en la permeabilidad de la membrana bacteriana suelen estar asociadas con la fuga de componentes intracelulares como el ácido desoxirribonucleico (ADN) o el ácido ribonucleico (ARN). Las biopelículas de MRSA en Ti-PDA @ SNP-OGP demostraron una concentración notablemente alta de fuga de componentes intracelulares después de la irradiación NIR (P < 0,05 o P < 0,01, archivo adicional 1: Fig. S3i), lo que es consistente con el resultado de ONPG hidrólisis. En conjunto, estos resultados indican que el estrés oxidativo mediado por ROS, la destrucción de la integridad de la membrana bacteriana y la fuga de componentes intracelulares fueron los factores principales de la muerte bacteriana y la erradicación de las biopelículas de MRSA inducidas por Ti-PDA@SNP-OGP.

La morfología y el área de propagación de las MSC se evaluaron mediante tinción fluorescente. Como se muestra en la Fig. 3a, las MSC cultivadas en sustrato de Ti o de Ti funcionalizado exhibieron una morfología en forma de huso. Se identificaron más seudópodos a partir de MSC cultivadas en Ti-PDA@SNP-OGP. El análisis cuantitativo indicó que el área de propagación de las MSC era mayor en Ti-PDA@SNP-OGP, en comparación con otros grupos (P < 0,01, Archivo adicional 1: Fig. S4a). La viabilidad celular de las MSC se evaluó mediante el ensayo CCK-8 después de cultivar durante 1, 4 y 7 días. En comparación con las células cultivadas en Ti, Ti-PDA y Ti-PDA@SNP, la viabilidad celular de las MSC cultivadas en Ti-PDA@SNP-OGP fue significativamente mayor (P < 0,05 o P < 0,01, Fig. 3b). Después de la irradiación NIR durante 10 min, la viabilidad celular de las MSC en Ti se redujo al 85,4 %, que fue superior a la de Ti-PDA (68,9 %), Ti-PDA@SNP (53,2 %) y Ti-PDA@SNP- OGP (58,8 %), respectivamente (P < 0,01, Archivo adicional 1: Fig. S4b). Mientras tanto, las viabilidades celulares en Ti-PDA @ SNP y Ti-PDA @ SNP-OGP fueron significativamente más bajas que en Ti-PDA (P <0.05, Archivo adicional 1: Fig. S4b). Luego, las células se cultivaron más en condiciones normales y se encontró que la viabilidad celular de las MSC disminuyó significativamente en Ti-PDA @ SNP-OGP que en Ti después de 1 día (P <0.01). No se identificaron diferencias estadísticamente significativas el día 4 entre los grupos Ti y Ti-PDA@SNP-OGP (P > 0,05), mientras que se encontró una diferencia significativa el día 7 (P < 0,01, Archivo adicional 1: Fig. S4c). La viabilidad celular (determinada mediante el ensayo LDH) de las MSC cultivadas en Ti-PDA@SNP-OGP irradiado con NIR se aproximó a la del grupo de control positivo (MSC cultivadas en Ti sin MSRA). Sin embargo, después de la irradiación NIR, las viabilidades celulares en Ti, Ti-PDA y Ti-PDA@SNP fueron significativamente más bajas que en Ti-PDA@SNP-OGP (P < 0.01, Archivo adicional 1: Fig. S4d). Después de la eliminación del biofilm, realizamos el ensayo de tinción fluorescente y actividad ALP para evaluar el potencial osteogénico de Ti-PDA@SNP-OGP. Ti-PDA@SNP-OGP (virgen) sin irradiación NIR se utilizó como control. Las MSC cultivadas en Ti-PDA@SNP-OGP (usado) y Ti-PDA@SNP-OGP (virgen) exhibieron morfologías normales similares y no se encontraron diferencias obvias, lo que refleja indirectamente que Ti-PDA@SNP-OGP irradiado con NIR podría efectivamente erradicar las biopelículas de MRSA pero no afectar la función biológica de las MSC (Archivo adicional 1: Fig. S4e). Además, la actividad ALP de las MSC en Ti-PDA@SNP-OGP (después de que se erradicaron las biopelículas de MRSA) fue significativamente mayor (P < 0.05) que en Ti (Archivo adicional 1: Fig. S4f).

Evaluación de proliferación celular y osteogénesis de MSC en Ti o sustrato de Ti funcionalizado. a Imágenes de fluorescencia de MSC en sustrato de Ti o Ti funcionalizado, Hoechst 33258 (azul) y actina (rojo). Barra de escala = 200 μm. b Proliferación celular de MSC en Ti o sustrato de Ti funcionalizado mediante ensayo CCK-8. c Actividad ALP de MSC en Ti o sustrato de Ti funcionalizado después de la incubación durante 7 días. d La secreción de colágeno de MSC en Ti o sustrato de Ti funcionalizado se detectó y cuantificó mediante tinción con rojo Sirius. La mineralización de ECM de las MSC en cada muestra se midió y cuantificó mediante tinción con rojo de alizarina. f Expresión de ARNm de genes relacionados con la osteogénesis Runx2, BMP2, OPN y OCN medida por qRT‑PCR. *P < 0,05, **P < 0,01; Tititanio, nanopartículas de polidopamina PDA, nitroprusiato de sodio SNP, péptido de crecimiento osteogénico OGP, células estromales de la médula ósea de MSC, fosfatasa alcalina ALP, matriz extracelular ECM, factor de transcripción 2 relacionado con runt Runx2, proteína morfogenética ósea 2 BMP2, osteopontina OPN, osteocalcina OCN, qRT ‑PCR cuantitativa en tiempo real transcriptasa inversa‑reacción en cadena de la polimerasa

Después de cultivar durante 7 días, las MSC que se cultivaron en Ti-PDA @ SNP-OGP exhibieron una actividad ALP más alta que las de otros grupos (P <0.01, Fig. 3c). Se observó una tendencia similar para la secreción de colágeno y la mineralización de ECM (Fig. 3d, e). qRT-PCR se utilizó para investigar los perfiles de expresión de ARNm de genes relacionados con la osteogénesis [factor de transcripción relacionado con Runt 2 (Runx2), proteína morfogenética ósea 2 (BMP2), osteopontina (OPN), osteocalcina (OCN)] en MSC, y el Se encontró que los niveles de expresión de Runx2, BMP2, OPN y OCN eran notablemente más altos en Ti-PDA @ SNP-OGP que en otros grupos (P <0.05 o P <0.01, Fig. 3f).

La morfología de las células RAW264.7 cultivadas en sustrato Ti o Ti funcionalizado se observó por primera vez mediante tinción fluorescente. Se observaron más seudópodos (indicados por círculos blancos con líneas de puntos) en células RAW264.7 cultivadas en Ti-PDA@SNP-OGP, en comparación con las cultivadas en Ti, Ti-PDA o Ti-PDA@SNP (Fig. 4a). Las imágenes SEM mostraron que, en comparación con otros grupos, más células RAW264.7 se adhirieron al sustrato Ti-PDA @ SNP-OGP (Fig. 4b) Además, Ti-PDA @ SNP-OGP mejoró significativamente la proliferación de células RAW264.7 en comparación con otros grupos (P < 0.01, Fig. 4c). Además, la polarización de los macrófagos también se evaluó mediante qRT-PCR. Como se muestra en la Fig. 4d, los genes marcadores M1 (CD86, iNOS y CD11C) mostraron una tendencia descendente significativa por Ti-PDA@SNP-OGP en comparación con otros grupos (P < 0,05 o P < 0,01), lo que sugiere su actividad antiinflamatoria. . En comparación, los niveles de expresión de ARNm de los genes marcadores M2 (CD206, Arg-1 y CD163) aumentaron significativamente con Ti-PDA@SNP-OGP en comparación con Ti, Ti-PDA o Ti-PDA@SNP (P < 0,01 ).

Efectos de Ti o sustrato de Ti funcionalizado sobre la reprogramación del fenotipo de macrófagos y la capacidad antiinflamatoria in vitro. a Tinción de citoesqueleto de células RAW 264.7 en Ti o sustrato de Ti funcionalizado después de cultivar durante 24 h, Hoechst 33258 (azul) y actina (rojo). Barra de escala = 50 μm. Los círculos punteados blancos representan el seudópodo. b Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de células RAW264.7 en Ti o sustrato de Ti funcionalizado después de cultivar durante 24 h. Barra de escala = 5 μm. c Viabilidad celular de células RAW264.7 en varias muestras después de cultivarlas durante 1, 3 y 5 días. d expresión de ARNm de genes marcadores M1 CD86, iNOS y CD11C y genes marcadores M2 CD206, Arg-1 y CD163 en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS). e Expresión de ARNm de los genes Runx2, BMP2, VEGF y TGF-β en células RAW264.7. f Expresión de ARNm de genes proinflamatorios IL-1β y TNF-α y genes antiinflamatorios IL-1ra e IL-10 en células RAW264.7 estimuladas con LPS. *P < 0,05, **P < 0,01; Titanio titanio, nanopartículas de polidopamina PDA, nitroprusiato de sodio SNP, péptido de crecimiento osteogénico OGP, grupo de diferenciación CD86 86, óxido nítrico sintasa inducible iNOS, grupo de diferenciación CD11C 11C, grupo de diferenciación CD206 206, arginasa-1 Arg-1, grupo de CD163 diferenciación 163, Runx2 runt-related transcription factor 2, proteína morfogenética ósea 2 BMP2, VEGF factor de crecimiento endotelial vascular, TGF-β factor de crecimiento transformante-β, IL-1β interleucina-1β, TNF-α factor de necrosis tumoral-α, IL- 1ra interleucina-1ra, IL-10 interleucina-10

Los niveles de expresión de ARNm de Runx2, BMP2, VEGF y TGF-β se investigaron más a fondo en células RAW264.7. En comparación con Ti, los niveles de expresión de ARNm de Runx2, BMP2, VEGF y TGF-β en Ti-PDA@SNP-OGP aumentaron hasta 1,8, 2,5, 3,1 y 2,7 ​​veces, respectivamente (P <0,01, Fig. 4e). También se evaluó el potencial antiinflamatorio de Ti-PDA@SNP-OGP. En comparación con otros grupos, los niveles de expresión de ARNm de los genes proinflamatorios IL-1β y TNF-α estaban regulados a la baja en Ti-PDA@SNP-OGP, mientras que mostró la tendencia opuesta con una mayor expresión de ARNm de genes antiinflamatorios IL -1ra e IL-10 (P < 0,01, Fig. 4f). En conjunto, estos resultados destacan el efecto de promoción de Ti-PDA@SNP-OGP para revertir el microentorno proinflamatorio adverso y para reprogramar los macrófagos en el fenotipo M2, creando así un microentorno pro-regenerativo.

Se evaluó el potencial de diferenciación osteogénica de las MSC y la expresión de factores inflamatorios por células RAW264.7 después de la irradiación NIR. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre Ti-PDA@SNP-OGP y Ti-PDA@SNP-OGP irradiado con NIR (P > 0.05), mientras que la mineralización de MSC en Ti-PDA@SNP-OGP fue mayor que en otros grupos después de NIR irradiación (P <0.01, Archivo adicional 1: Fig. S4g). Además, después de la irradiación NIR durante 10 minutos, el nivel de expresión de ARNm del marcador M1 CD86 en Ti-PDA@SNP-OGP en células RAW264.7 fue significativamente menor que en otros grupos (P < 0,01, Archivo adicional 1: Fig. S4h). Además, no hubo diferencias estadísticamente significativas en el nivel de expresión de CD86 entre Ti-PDA@SNP-OGP y Ti-PDA@SNP-OGP irradiado con NIR (P > 0,05). Se observó una tendencia opuesta para la expresión del marcador M2 CD206 en células RAW264.7 (Archivo adicional 1: Fig. S4h). Después de la eliminación del biofilm, se investigó in vitro la interacción de las MSC con el Ti-PDA@SNP-OGP utilizado utilizando ensayos de actividad CCK-8 y ALP. Las MSC en Ti-PDA@SNP-OGP utilizadas por primera o segunda vez mostraron una viabilidad celular significativamente mayor que las de Ti o Ti-PDA@SNP-OGP utilizadas tres veces (P < 0,05 o P < 0,01, archivo adicional 1: Figura S4i). De manera similar, las actividades ALP de las MSC en Ti-PDA@SNP-OGP usadas por primera o segunda vez fueron más altas que las de Ti o Ti-PDA@SNP-OGP usadas tres veces después de la incubación durante 7 días (P < 0.05, Adicional archivo 1: Fig. S4j). En conjunto, los resultados indican que la hipertermia y la liberación de NO activada por fototermia por Ti-PDA@SNP-OGP pueden repetirse dos veces para erradicar las biopelículas establecidas y mejorar la diferenciación osteogénica de las MSC después de la erradicación de la biopelícula.

Se encontró que las células RAW264.7 expuestas a Ti-PDA@SNP-OGP tenían expresiones significativamente mejoradas de ARNm y proteínas de Runx2, BMP2, VEGF y TGF-β (P < 0.01, Archivo adicional 1: Fig. S5a, b). Además, se utilizó un sistema de cocultivo Transwell para evaluar más a fondo el efecto osteogénico de promoción in vitro de las células RAW264.7 inducidas por Ti-PDA@SNP-OGP en las MSC. Las células RAW264.7 se sembraron en diferentes sustratos en la cámara inferior y las MSC se cultivaron en la cámara superior (Archivo adicional 1: Fig. S5c). Después del cultivo conjunto durante 1 día, se encontraron más MSC migradas en Ti-PDA@SNP-OGP (Archivo adicional 1: Fig. S5d), que tuvo la mayor migración transmembrana entre todos los grupos (P < 0,05 o P < 0,01). El análisis cuantitativo mostró que la actividad de ALP, los niveles de secreción de colágeno y la mineralización de ECM de las MSC fueron significativamente más altos en Ti-PDA @ SNP-OGP que en otros grupos (P <0.01). De manera similar, se encontraron áreas más grandes de fibras de colágeno teñidas con rojo Sirio y áreas de depósitos de calcio teñidas con rojo Alizarina en Ti-PDA@SNP-OGP (Archivo adicional 1: Fig. S5e). Además, los niveles de expresión de los genes relacionados con la osteogénesis Runx2, BMP2, ALP, OPN y OCN fueron los más altos en el grupo Ti-PDA@SNP-OGP (P < 0.01, Archivo adicional 1: Fig. S5f).

Para verificar los resultados in vitro, se estableció con éxito un modelo de implantación de defecto femoral infectado con MRSA (Archivo adicional 1: Fig. S6a). Las imágenes SEM mostraron que Ti-PDA@SNP-OGP no se dañó durante la implantación (Archivo adicional 1: Fig. S6b). Antes de la implantación, las varillas de Ti y Ti-PDA@SNP-OGP se incubaron con biopelículas de MRSA durante 2 días. La formación de biopelículas de MRSA en los implantes se examinó con SEM. Se encontró que todos los implantes estaban cubiertos con biopelículas de MRSA después de la incubación con suspensión de MRSA durante 2 días (Archivo adicional 1: Fig. S6c). El MRSA adherente en todos los implantes fue exfoliado por energía ultrasónica. El análisis cuantitativo indicó que MRSA se podía encontrar en Ti (2,71 × 107 CFU), Ti-PDA (2,60 × 107 CFU), Ti-PDA@SNP (2,46 × 107 CFU) y Ti-PDA@SNP-OGP (2,66 × 107 UFC).

Un día después de la implantación, los sitios de implantación del implante Ti o Ti-PDA@SNP-OGP se expusieron a irradiación láser a 808 nm. Se registraron imágenes fototérmicas y los cambios de temperatura correspondientes (Archivo adicional 1: Fig. S6d). Después de la irradiación durante 10 min, el cambio de temperatura (∆T) del implante Ti-PDA@SNP-OGP fue de 23,7 °C, significativamente mayor que el del implante Ti (12,1 °C, P < 0,01, archivo adicional 1 : Figura S6e). Después de la implantación durante 3 días, ambos implantes se retiraron suavemente y se sumergieron en MHB durante 12 horas. Después de la incubación en la oscuridad, el medio MHB que contenía el implante Ti o Ti-PDA@SNP-OGP era feculento. Esto es indicativo de las capacidades antibacterianas insuficientes de Ti y Ti-PDA@SNP-OGP sin irradiación NIR. Después de la irradiación NIR, el medio MHB que contenía el implante Ti-PDA@SNP-OGP se volvió claro, mientras que el medio MHB que contenía el implante Ti permaneció feculento (Archivo adicional 1: Fig. S6f). El análisis cuantitativo de las placas extendidas mostró que solo el 6,2% de las biopelículas de MRSA se eliminaron sin irradiación NIR. Por el contrario, más del 95,7 % de las biopelículas de MRSA en el implante Ti-PDA@SNP-OGP se erradicaron después de la irradiación NIR (P < 0,01, Archivo adicional 1: Fig. S6g). Se utilizó espectroscopia de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES) para investigar el contenido de iones de Fe en la médula femoral intraluminal para determinar la degradación in vivo de Ti-PDA @ SNP-OGP en puntos de tiempo predeterminados (0.5, 1, 3, 7, 14 y 28 d). El porcentaje de iones Fe que se acumularon en la médula femoral intraluminal fue de 7.54% en Ti-PDA@SNP-OGP a los 28 d. En particular, la vida media de OGP en sustrato Ti-PDA @ SNP-OGP in vivo fue de aproximadamente 7 días. Por el contrario, la cantidad acumulada de iones de Fe en Ti fue solo del 0,9% (P <0,01, Archivo adicional 1: Fig. S6h). En conjunto, la evaluación microbiológica demostró que el implante Ti-PDA@SNP-OGP mostró un efecto de erradicación de biopelícula de MRSA y antibacteriano y fototérmico combinado in vivo.

Para evaluar el potencial antiinflamatorio se realizó ELISA para cuantificar la concentración de citocinas excretivas proinflamatorias (TNF-α e IL-6) y antiinflamatorias (TGF-β e IL-10). Ti-PDA @ SNP-OGP irradiado con NIR tenía los niveles más bajos de expresión de proteínas de TNF-α e IL-6 (P <0.01, Archivo adicional 1: Fig. S6i). Los contenidos de TNF-α e IL-6 fueron significativamente mayores en Ti-PDA@SNP-OGP que en Ti-PDA@SNP-OGP irradiado con NIR, mientras que mostró una tendencia opuesta con mayores contenidos de citocinas antiinflamatorias TGF -β e IL-10 secretados por este último (P <0.01, Archivo adicional 1: Fig. S6i), que se atribuyó a la generación de NO activada fototérmicamente.

Se usaron las tinciones de HE y Giemsa para analizar la respuesta inflamatoria 3 días después de la implantación in vivo. Solo se identificaron unas pocas células inflamatorias (indicadas con flechas rojas) y bacterias residuales (indicadas con flechas rojas) en Ti-PDA@SNP-OGP irradiado con NIR, lo que se confirmó aún más mediante resultados cuantitativos (P < 0,05 o P < 0,01, Archivo adicional 1: Fig. S7a). Por el contrario, se observó una profusa infiltración de células inflamatorias y muchas células MRSA en otros grupos (P <0.01, Archivo adicional 1: Fig. S7b).

En la interfaz hueso-implante, se realizó la tinción IHC para macrófagos M1 con CD86 y macrófagos M2 con CD206 (Archivo adicional 1: Fig. S7c). En Ti-PDA @ SNP-OGP irradiado con NIR, la distribución de macrófagos positivos para CD86 presentó una disminución notable, mientras que mostraron una tendencia predominantemente más fuerte de macrófagos positivos para CD206. En conjunto, estos resultados demuestran el potencial del implante para mediar en la reprogramación del fenotipo antiinflamatorio y macrófago, en línea con los resultados in vitro.

Como se muestra en la Fig. 5a, se observó más formación de hueso nuevo en el grupo Ti-PDA @ SNP-OGP que había sido sometido a irradiación NIR. Se investigaron y calcularon los porcentajes de volumen de hueso nuevo sobre el volumen óseo total (BV/TV), el grosor de la placa trabecular (Tb.Th), el número trabecular (Tb.N) y la separación trabecular (Tb.Sp). Los porcentajes más altos de BV/TV, Tb.Th y Tb.N y el porcentaje más bajo de Tb.Sp se encontraron en Ti-PDA@SNP-OGP irradiado con NIR (Fig. 5b, Archivo adicional 1: Fig. S7d) . Como se muestra en la Fig. 5c, se observó abundante formación de tejido óseo nuevo en la superficie de Ti-PDA @ SNP-OGP irradiado con NIR, mientras que solo se encontró una pequeña cantidad de hueso nuevo en Ti, Ti irradiado con NIR o Ti-PDA @SNP-OGP después de 4 semanas de tratamiento. Se obtuvieron resultados similares para la tinción tricrómica de Masson. Ti-PDA@SNP-OGP irradiado con NIR exhibió el mayor porcentaje de área de hueso nuevo (37,5 %) y contacto hueso-implante (34,3 %) (P < 0,05 o P < 0,01, Archivo adicional 1: Fig. S7e ), consistente con los resultados de micro-CT. La evaluación adicional de las proteínas relacionadas con la formación de hueso (ALP y OPN) alrededor de los tejidos óseos periimplantarios con tinción IHC identificó más áreas teñidas positivamente de ALP y OPN en Ti-PDA@SNP-OGP. En comparación con Ti, Ti irradiado con NIR y Ti-PDA@SNP-OGP, Ti-PDA@SNP-OGP irradiado con NIR mostró una expresión significativamente mejorada de CD31 (marcador de vascularización) alrededor de los implantes (Archivo adicional 1: Fig. S7f).

Regeneración ósea en un modelo de implantación de defecto femoral infectado con SARM in vivo. Imágenes de Micro-CT de hueso nuevo. Barra de escala = 400 μm. b Análisis cuantitativo de tejidos óseos recién formados basado en imágenes de reconstrucción tridimensionales (3D) de micro-CT, incluido volumen óseo/volumen total (BV/TV), grosor trabecular (Tb.Th) y número trabecular (Tb. N) después de 4 semanas. c Imágenes representativas de HE y tinción tricrómica de Masson en la interfaz hueso-implante. Barra de escala = 200 μm. **P < 0,01; Titanio titanio, nanopartículas de polidopamina PDA, nitroprusiato de sodio SNP, péptido de crecimiento osteogénico OGP, hematoxilina y eosina HE

La bioseguridad de la temperatura suave (~51 °C) inducida por PTT de Ti-PDA@SNP-OGP in vivo se evaluó mediante análisis bioquímicos de sangre completa, incluidos glóbulos blancos (WBC), granulocitos neutrófilos (NEUT), glóbulos rojos ( RBC), hemoglobina (HGB), hematocrito (HCT) y plaquetas (PLT). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre Ti y Ti-PDA@SNP-OGP irradiado con NIR para los indicadores WBC, NEUT, RBC, HGB, HCT y PLT (Archivo adicional 1: Fig. S8). Estos resultados indican que no hubo riesgos obvios asociados con la terapia Ti-PDA@SNP-OGP y NIR dentro del cuerpo.

En este estudio, las nanopartículas de PDA se encapsularon con SNP fototérmicamente sensible y se modificaron con OGP, y se formó un recubrimiento de dopamina en Ti para cargar nanopartículas de PDA@SNP-OGP y construir Ti-PDA@SNP-OGP (Fig. 6). Como factor osteogénico, la OGP se ha utilizado ampliamente para aumentar el potencial de diferenciación osteogénica de los materiales de reparación ósea al mejorar la proliferación y diferenciación de las células del linaje de los osteoblastos in vivo. En nuestros estudios anteriores, se identificó que OGP es un factor osteoinmunomodulador efectivo para mejorar la capacidad antiinflamatoria de las células RAW264.7 y aumentar el efecto osteogénico de las MSC [41,42,43]. Bai et al. [44] fabricó una OGP modificada que contiene catecol tetravalente (DOPA) 4 con adhesión de mejillón y funciones osteoinmunomoduladoras para la osteointegración avanzada a través de la supresión de las respuestas inflamatorias y la regulación positiva del fenotipo M2 de los macrófagos. Sin embargo, la pobre capacidad antibacteriana hizo que los implantes de Ti modificado con OGP tuvieran aplicaciones extremadamente limitadas en la clínica [44,45,46]. Numerosos estudios se han centrado únicamente en la funcionalización de los implantes de Ti modificados con OGP, como función única (capacidad antibacteriana o osteointegración mejorada) o función dual (incluida capacidad antibacteriana y osteointegración mejorada). Sin embargo, esos enfoques no mejoran la osteointegración del implante en presencia de múltiples comorbilidades (p. ej., infección bacteriana, inflamación). La aparición de MRSA y sus biopelículas en las superficies de los implantes de Ti exacerba la situación y, por lo tanto, provoca el fracaso de los implantes de Ti [47]. Por esta razón, diseñamos un recubrimiento multifuncional en Ti que podría regular la diafonía entre las células RAW264.7 y las MSC para mejorar la osteointegración y proporcionar capacidades antibacterianas y de eliminación de biopelículas mediante la irradiación NIR.

Diagramas esquemáticos que muestran que Ti-PDA@SNP-OGP elimina las biopelículas de MSRA a través de NO activado fototérmicamente e inmunoterapia para mejorar la osteointegración. Titanio titanio, nanopartículas de polidopamina PDA, nitroprusiato de sodio SNP, péptido de crecimiento osteogénico OGP, óxido nítrico NO, factor de crecimiento endotelial vascular VEGF, factor de crecimiento transformante β TGF-β, interleucina 10 IL-10, factor de necrosis tumoral α TNF‑α

Debido al excelente efecto fototérmico de la PDA, la hipertermia localizada inducida por la energía de la luz irradiada con láser para la eliminación de las biopelículas establecidas fue ampliamente utilizada [21, 23]. El incremento de temperatura por un agente fototérmico está relacionado con factores como su concentración, la densidad del láser, el tiempo de irradiación del láser y la temperatura ambiente [20, 21]. Sin embargo, las biopelículas solo se erradican mediante la aplicación de radiación NIR a 70 °C. Tal temperatura inevitablemente reduce la viabilidad de la célula huésped al inducir apoptosis o necrosis [48]. En contraste, la temperatura suave (~52 °C) inducida por PTT produce menos efectos adversos, pero las capacidades antibacterianas y de erradicación de biopelículas también se reducen significativamente a esa temperatura suave [23]. En este estudio, Ti-PDA@SNP-OGP convirtió la energía luminosa irradiada con láser en hipertermia localizada. El aumento de la temperatura del tejido, a su vez, desencadenó la liberación de NO de SNP de manera "bajo demanda" debido a la destrucción del apilamiento π-π y/o la adsorción física entre las nanopartículas de SNP y PDA [40]. Para minimizar los efectos adversos, se emplearon 0,5 mg/ml de nanopartículas de PDA@SNP-OGP con una intensidad de láser de 1,0 W/cm2 durante 10 min para investigar el efecto fototérmico y la temperatura alcanzó aproximadamente los 52 °C. La hipertermia reunida por Ti-PDA@SNP-OGP podría destruir la membrana bacteriana y posteriormente provocar la fuga de proteínas de MRSA, lo que resultaría en la capacidad antibacteriana deseable. Estos resultados son consistentes con estudios previos [49, 50]. La liberación de NO puede mejorar el efecto antibacteriano al causar estrés oxidativo y nitrosativo y romper el metabolismo del nitrógeno bacteriano [51, 52]. En base a estos resultados, la liberación controlable y rápida de NO mediante irradiación NIR es un armamento útil para la eliminación de biopelículas en poco tiempo y no requiere temperaturas exorbitantes.

Los implantes ideales deben presentar una excelente citocompatibilidad para regular las funciones fundamentales de las células relacionadas con la osteogénesis [53, 54]. La viabilidad celular, la actividad ALP, la secreción de colágeno y la mineralización de ECM mejoran significativamente con Ti-PDA@SNP-OGP. En este estudio, los genes relacionados con la osteogénesis Runx2, BMP2, OPN y OCN se regularon significativamente en Ti-PDA@SNP-OGP en comparación con otros grupos. Estos resultados indican que Ti-PDA@SNP-OGP tiene el potencial de mejorar la diferenciación osteogénica de las MSC [42, 43].

Una vez que el implante se ha incrustado en los tejidos óseos, las células inmunitarias, como los macrófagos, se reclutan en el sitio del implante en unas pocas horas; estas células inmunes generan una cascada de eventos que conducen a la respuesta inflamatoria temprana [55,56,57,58,59]. Una respuesta inflamatoria es beneficiosa para mejorar la cicatrización ósea porque se reclutan MSC óseas y se estimula la angiogénesis [60,61,62]. En la última etapa de la inflamación, los macrófagos M1 se polarizarán en el fenotipo M2 para aliviar la inflamación y secretar citocinas antiinflamatorias para facilitar la regeneración ósea [63,64,65,66,67]. Sin embargo, los macrófagos multifuncionales no pueden experimentar una transición fenotípica en condiciones patológicas [59]. La inflamación persistente y severa da como resultado niveles elevados de citocinas proinflamatorias en los tejidos óseos circundantes. Estas citocinas proinflamatorias aumentan la actividad de los osteoclastos y disminuyen el reclutamiento o la migración de las MSC. Esto da como resultado una desconexión ósea y una osteointegración deficiente [68,69,70,71,72]. En este estudio, Ti-PDA@SNP-OGP reguló significativamente a la baja los niveles de expresión de ARNm de los marcadores M1 CD86, iNOS y CD11C y reguló al alza los niveles de expresión de ARNm de los marcadores M2 CD206, Arg-1 y CD163. Además, los niveles de expresión de ARNm de los genes Runx2, BMP2, VEGF y TGF-β aumentaron significativamente mediante Ti-PDA@SNP-OGP. Además, en comparación con otros grupos, Ti-PDA@SNP-OGP también inhibió los niveles de expresión de ARNm de las citoquinas proinflamatorias IL-1β y TNF-α y mejoró la expresión de las citoquinas antiinflamatorias IL-1ra e IL-10. Esto podría deberse al efecto osteoinmunomodulador de Ti-PDA@SNP-OGP [42, 46].

La diafonía entre las MSC y las células RAW264.7 juega un papel vital en la mejora de la osteointegración del implante [72,73,74]. Por lo tanto, el efecto de inducción osteogénica de las células RAW264.7 en las MSC tras la estimulación de Ti-PDA @ SNP-OGP debe considerarse cuidadosamente. Las expresiones de ARNm y proteínas de Runx2, BMP2, VEGF y TGF-β en células RAW264.7 aumentaron, lo que podría atribuirse a la inmovilización de OGP en Ti para estimular a las células RAW264.7 a secretar mediadores osteogénicos [44, 46]. Las MSC en Ti-PDA@SNP-OGP exhibieron la migración transmembrana más alta entre todos los grupos después del cocultivo con células RAW264.7. Además, la actividad de ALP, la secreción de colágeno y la mineralización de ECM en Ti-PDA@SNP-OGP fueron mayores que en Ti, Ti-PDA o Ti-PDA@SNP. Además, se demostró que Ti-PDA@SNP-OGP estimula la expresión de genes relacionados con la osteogénesis Runx2, BMP2, ALP, OPN y OCN en MSC. Con base en los resultados anteriores, sugerimos que Ti-PDA@SNP-OGP es un inmunomodulador óseo potencialmente efectivo que mejora la liberación de mediadores antiinflamatorios de las células RAW264.7 para mejorar la migración y diferenciación de MSC a través de múltiples señales paracrinas. de Runx2, BMP2, VEGF y TGF-β.

Para la evaluación de las capacidades antibacterianas y antiinflamatorias in vivo, más del 95,7 % de las biopelículas de MRSA en los implantes Ti-PDA@SNP-OGP se erradicaron después de la irradiación NIR. Además, solo se observaron unas pocas células inflamatorias y bacterias residuales en Ti-PDA@SNP-OGP después de la irradiación NIR, debido a los efectos sinérgicos de la hipertermia leve y la liberación de NO activada por fototermia en la eliminación del biofilm MRSA [17, 23]. Los mecanismos antibacterianos potenciales para nuestro Ti-PDA@SNP-OGP diseñado se elaboraron a continuación. En primer lugar, la hipertermia hace que las bacterias sean más sensibles al entorno externo y, posteriormente, puede dañar eficazmente la membrana bacteriana, lo que puede desempeñar un papel dominante en el proceso de eliminación del biofilm MRSA. En segundo lugar, el NO activado fototérmicamente podría interrumpir el metabolismo del nitrógeno, inducir estrés nitrosativo/oxidativo y conducir a la muerte por MRSA. En tercer lugar, la inmunoterapia puede mejorar las defensas del huésped contra las bacterias invasoras y mejorar la propiedad antibacteriana contra las bacterias residuales [75]. Además, Ti-PDA@SNP-OGP posee una mejor capacidad para suprimir las respuestas inflamatorias a través de la regulación negativa de las citoquinas proinflamatorias TNF-α e IL-6 y la regulación positiva de las citoquinas antiinflamatorias TGF-β e IL-10. La respuesta antiinflamatoria mejorada podría atribuirse a la excelente actividad antibacteriana de Ti-PDA @ SNP-OGP irradiado con NIR y al efecto inmunomodulador de OGP [42]. Los resultados de ICP-AES in vivo sugirieron que Ti-PDA@SNP-OGP se distribuía principalmente en la cavidad de la médula ósea de los fémures. El recubrimiento de Ti-PDA@SNP-OGP se degradó rápidamente en los primeros 7 días, seguido de una disminución de la degradación durante los siguientes 21 días. Estos resultados demostraron que Ti-PDA@SNP-OGP poseía características de degradación sostenida. Tal característica es beneficiosa para mejorar la osteointegración.

Micro-CT confirmó que los porcentajes más altos de BV/TV, Tb.Th y Tb.N y el porcentaje más bajo de Tb.Sp se encontraron en Ti-PDA@SNP-OGP. La tinción IHC de las proteínas relacionadas con la formación de hueso ALP, OPN y CD31 sugirió que Ti-PDA @ SNP-OGP irradiado con NIR presentó una mejor osteogénesis en comparación con otros grupos, como lo demuestra la mayor expresión de ALP, OPN y OCN. En conjunto, se logró simultáneamente una excelente osteointegración debido al efecto osteoinmunomodulador de Ti-PDA@SNP-OGP.

Es necesario abordar más a fondo varias limitaciones. El efecto fototérmico sobre las funciones fisiológicas de las MSC y las células RAW264.7 debe explorarse más a fondo. Si las propiedades bioactivas de OGP después de la irradiación NIR podrían inactivarse y la liberación in vivo de NO en un modelo de implantación de fémur infectado debe investigarse a fondo. El NO es una molécula inflamatoria, por lo que se debe investigar más a fondo la retroalimentación del NO a los macrófagos y sus posibles influencias adversas en los tejidos circundantes. En términos de comportamiento celular, exhibe propiedades dinámicas, acopladas y reguladas espaciotemporalmente, sin embargo, las funciones fisiológicas de las MSC y los macrófagos no fueron controladas con precisión por nuestros implantes de Ti fabricados en respuesta a señales espaciotemporales. Por lo tanto, la fabricación de implantes multifuncionales de titanio que logren un control preciso de las funciones fisiológicas de las células MSC y RAW264.7, así como excelentes propiedades antibacterianas y de erradicación de biopelículas, podría ser un enfoque más racional para mejorar la osteointegración.

En este estudio, propusimos por primera vez una nueva interfaz multifuncional activable por NIR con PTT sensible potenciado por NO y OGP osteoinmunomoduladora en implantes de Ti, basada en una funcionalización interfacial mediada por PDA, para la erradicación de biopelículas de MRSA y osteointegración mejorada. Demostramos que Ti-PDA@SNP-OGP es una plataforma ideal para la liberación controlada de NO. Específicamente, NO se cargó en Ti-PDA@SNP-OGP a través de una interacción especial de apilamiento π-π y/o adsorción física entre la molécula SNP y PDA. Se descubrió que Ti-PDA@SNP-OGP muestra un fuerte efecto fototérmico con la irradiación láser de 808 nm, lo que proporcionó una condición de estimulación externa ideal para la liberación controlada de NO. En particular, la liberación de NO podría controlarse con precisión mediante irradiación NIR intermitente, mostrando un modo de interruptor de "encendido-apagado".

Tras la irradiación NIR, Ti-PDA@SNP-OGP mostró un efecto fototérmico sinérgico y antibacteriano NO al inhibir significativamente el crecimiento de MRSA. Además, las biopelículas formadas por MRSA fueron eliminadas de manera efectiva por el tratamiento combinado fototérmico y NO. El mecanismo antibacteriano indicó que las bacterias tratadas con Ti-PDA@SNP-OGP fueron esterilizadas por estrés oxidativo mediado por ROS, destrucción de la integridad de la membrana bacteriana y fuga del contenido bacteriano. Los experimentos in vitro revelaron que Ti-PDA@SNP-OGP no solo facilitó la diferenciación osteogénica de las MSC, sino que también suprimió los macrófagos M1, mientras que estimuló el fenotipo M2 favorable a la curación, remodelando así el microambiente dañado en un microambiente favorable a la regeneración, que, en a su vez, facilitó la osteogénesis y suprimió la inflamación a través de la diafonía de vías de señalización múltiple.

Además, en un modelo de rata de infección asociada al implante, Ti-PDA@SNP-OGP eliminó las biopelículas de MRSA formadas, alivió la inflamación acompañante y medió en la osteoinmunomodulación, lo que resultó en una excelente osteointegración. Se observa que las evaluaciones de biocompatibilidad tanto in vitro como in vivo sugirieron que la terapia Ti-PDA@SNP-OGP y NIR eran seguras para aplicaciones biomédicas. En conjunto, el estudio proporciona una estrategia prometedora para la fabricación de implantes multifuncionales de Ti para erradicar las biopelículas de MRSA y mejorar la osteointegración.

Los datos y los materiales utilizados en el estudio actual están todos disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Fosfatasa alcalina

Arginasa-1

Trifosfato de adenosina

Infección asociada a biomateriales

Ácido bicinconínico

Proteína morfogenética ósea 2

N,N′-disecbutil-N,N′-dinitroso-p-fenilendiamina

Volumen óseo sobre volumen óseo total

Kit de conteo de células-8

Unidad de formación de Colonia

3,3ʹ-diaminobencidina

Diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína

Medio de águila modificado de Dulbecco

La matriz extracelular

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Sustancias poliméricas extracelulares

Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier

S-nitrosoglutatión

hematocrito

Hemoglobina

Hematoxilina y eosina

Espectroscopia de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente

inmunohistoquímica

interleucina‑6

interleucina‑10

Interleucina‑1β

Cargas de cohesión

Cargas de adherencia

lipopolisacárido

L-arginina

Caldo Mueller-Hinton

Staphylococcus aureus resistente a la meticilina

Células del estroma de la médula

Granulocitos de neutrófilos

Luz infrarroja cercana

Óxido nítrico

diolatos de diazenio

osteocalcina

Péptido de crecimiento osteogénico

O-nitrofenil-β-d-galactopiranósido

osteopontina

Nanopartículas de polidopamina

plaquetas

Terapia fototermal

Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real

las células rojas de la sangre

Especies de oxígeno reactivas

Factor de transcripción relacionado con Runt 2

Microscopía electrónica de barrido

nitroprusiato de sodio

número trabecular

separación trabecular

Grosor de la placa trabecular

Transformando el factor de crecimiento-β

Titanio

Factor de necrosis tumoral-α

Factor de crecimiento vascular endotelial

células blancas de la sangre

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Los autores agradecen a todos los estudiantes y técnicos del laboratorio por su colaboración.

Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82101069, 82102537, 82160411, 82002278), la Fundación de Ciencias Naturales de la Comisión de Ciencia y Tecnología de Chongqing (CSTC2021JCYJ-MSXMX0170, CSTB2022BSXM-JCX0039), el Primer Hospital Afiliado de Chongqing Medical Fondo de Cultivo Universitario (PYJJ2021-02), la Comisión Municipal de Ciencia y Tecnología de Beijing (Z221100007422130) y el Programa de Incubación Juvenil de Ciencia y Tecnología Médicas de PLA (21QNPY116).

Yong-Lin Yu, Jun-Jie Wu y Chuan-Chuan Lin contribuyeron igualmente a este trabajo.

Departamento de Patología, Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Zunyi, Zunyi, 563003, Guizhou, China

Yong Lin Yu

Centro de investigación de laboratorio, el primer hospital afiliado de la Universidad Médica de Chongqing, Chongqing, 400016, China

Jun-Jie Wu y Bai-Long Tao

Departamento de Transfusión de Sangre, Laboratorio de Radiobiología, Segundo Hospital Afiliado, Universidad Médica Militar del Ejército, Chongqing, 400037, China

Chuan Chuan Lin

Departamento de Endocrinología Reproductiva, Centro de Salud para Mujeres y Niños de Chongqing, Chongqing, 401147, China

Xianqin

La Escuela de Graduados, Universidad de Augusta, Augusta, GA, 30912, EE. UU.

franklin r tay

Departamento de Estomatología, Séptimo Centro Médico del Hospital General PLA, Beijing, 100700, China

Li Miao y Yang Jiao

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LM, BLT y YJ concibieron la idea del estudio, diseñaron los experimentos e interpretaron los datos. YLY, JJW, CCL y XQ realizaron los experimentos. LM, BLT y YJ escribieron el manuscrito. FRT, BLT y YJ revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia con Yong-Lin Yu, Li Miao, Bai-Long Tao o Yang Jiao.

Todos los experimentos con animales in vivo se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales y las regulaciones relevantes para la experimentación con animales de laboratorio de la Universidad Médica de Chongqing y el Séptimo Centro Médico del Hospital General PLA, y fueron aprobados por los Comités de Ética Animal de la Universidad Médica de Chongqing (2021- 738) y el Séptimo Centro Médico del Hospital General PLA (2021-110).

No aplica.

Los autores declaran no tener ningún interés financiero en competencia.

Cebadores qRT-PCR para MSC y células RAW 264.7 utilizadas en este estudio. Figura S1. Caracterización de Ti-PDA@SNP-OGP. Figura S2. Caracterización del sustrato Ti-PDA@SNP-OGP. Figura S3. Mecanismo de inhibición de las biopelículas de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina. Figura S4. Evaluación de biocompatibilidad, antiinflamación y duplicación de Ti o sustrato de Ti funcionalizado. Figura S5. Osteoinmunomodulación in vitro de Ti-PDA@SNP-OGP. Figura S6. Evaluación antibacteriana y antiinflamatoria in vivo. Figura S7. Antiinflamatorio, actividad antibacteriana y regeneración ósea in vivo. Figura S8. Bioseguridad de la temperatura suave inducida por PTT de Ti-PDA@SNP-OGP in vivo.

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Reimpresiones y permisos

Yu, YL., Wu, JJ., Lin, CC. et al. Eliminación de biopelículas de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina en implantes de titanio a través de óxido nítrico activado fototérmicamente e inmunoterapia para mejorar la osteointegración. Militar Med Res 10, 21 (2023). https://doi.org/10.1186/s40779-023-00454-y

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Recibido: 19 mayo 2022

Aceptado: 07 abril 2023

Publicado: 04 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s40779-023-00454-y

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